周慧文 單建偉 馮斗 嚴(yán)華兵

摘 ?要 ?應(yīng)用SCoT標(biāo)記對不同來源的28份木薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明：從36條引物中篩選出19條重復(fù)性好、條帶清晰的引物對28份木薯材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。共擴(kuò)增出171條帶，其中多態(tài)性條帶123條，平均每條引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶6.5條，多態(tài)性條帶比率為71.9%。經(jīng)NTSYS-pc2.10e軟件計(jì)算分析，28份木薯種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)在0.631～0.930之間。利用UPGMA法進(jìn)行聚類的結(jié)果顯示：在系數(shù)0.68處，木薯材料分為2大類，品種BRA354單獨(dú)成為一類;在系數(shù)為0.734處，28份木薯種質(zhì)資源主要聚為5大類，聚類結(jié)果與材料來源有一定相關(guān)性。SCoT標(biāo)記能在木薯種質(zhì)間檢測出一定程度的遺傳多樣性，可為木薯遺傳育種提供新的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 ?木薯;SCoT;分子標(biāo)記;遺傳多樣性

中圖分類號 ?S533 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Application of SCoT Molecular Marker in the

Genetic Diversity Analysis of Cassava

ZHOU Huiwen1，2， SHAN Jianwei1， FENG Dou1， YAN Huabing2 *

1 Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China

2 Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract ?In this paper，SCoT molecular marker technique，which can be used to detect markers associated with functional genes，was applied in the analysis of genetic diversity and relationships among 28 cassava accessions from different geographic locations. The results showed that，a total of 171 loci were detected with 19 primers screened from 36 SCoT primers in the tested accessions. In the 171 bands，123 were polymorphic with the polymorphism of 71.9%; and the average polymorphic number was 6.5 per primer. The genetic similarity coefficient among the accessions were calculated with NTSYS-pc2.10e software， and the value was between 0.631 and 0.930. The results of UPGMA clustering analysis showed that，28 cassava germplasms could be divided into two groups where the coefficient was 0.68; The accession BAR354 alone was clustered into one group，and the rest accessions were clustered into another group. The accessions could be divided into five groups where the coefficient was 0.734. This paper revealed that SCoT molecular marking technique could be used to detect some DNA polymorphism in cassava germplasms，which could provide a technical support for cassava breeding.

Key words ?Cassava; SCoT; Molecular marker; Genetic diversity

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.013

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯屬植物，耐旱抗貧瘠，廣泛種植于非洲、美洲和亞洲等100多個(gè)國家或地區(qū)[1]。木薯是三大薯類作物之一，熱帶地區(qū)第三大糧食作物，全球第六大糧食作物，被譽(yù)為“淀粉之王”，是世界近六億人賴以生存的糧食。木薯用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業(yè)產(chǎn)品，如淀粉、酒精等[2]。

作物種質(zhì)資源評價(jià)是作物遺傳改良的重要基礎(chǔ)，只有充分了解種質(zhì)資源，才能為育種工作提供科學(xué)依據(jù)。木薯是一種遺傳背景復(fù)雜、基因型高度雜合，有性子代嚴(yán)重分離的作物，這為木薯品種選育提供了眾多選擇機(jī)會。然而由于木薯種質(zhì)系譜不清，在雜交親本選配時(shí)存在很大的盲目性，育種效率低，造成大量人力、物力和財(cái)力的浪費(fèi)。結(jié)合植物學(xué)性狀調(diào)查與分析，利用分子標(biāo)記技術(shù)可為木薯雜交育種親本的選擇提供理論指導(dǎo)。隨著近年來分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，SSR、RFLP、RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)都曾相繼被應(yīng)用于木薯的遺傳多樣性分析中。早在1993年，Beeching等[3]就利用RFLP對木薯種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。在國內(nèi)，李開綿、王文泉等專家團(tuán)隊(duì)在木薯分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用方面做了大量工作，鄒積鑫等[4]利用微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）對中國89個(gè)木薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析;韋祖生等[5]利用EST-SSR標(biāo)記對木薯種質(zhì)庫進(jìn)行遺傳多樣性檢測;齊蘭等[6]也曾利用SRAP標(biāo)記對木薯品種進(jìn)行分類鑒定。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記（start condon targeted polymorphism，SCoT）是Collard和Mackill[7]在水稻上提出的基于SPAR（單引物擴(kuò)增反應(yīng)）的新的目的基因分子標(biāo)記方法，其原理是根據(jù)植物基因中的ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)單引物并對基因組進(jìn)行擴(kuò)增。SCoT標(biāo)記結(jié)合了ISSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，操作簡單，成本低廉，多態(tài)性豐富，能有效地產(chǎn)生與性狀聯(lián)系的標(biāo)記，是一種能跟蹤性狀的新的分子標(biāo)記，有利于分子標(biāo)記輔助育種[8-9]。已有前人將該技術(shù)成功應(yīng)用于龍眼[10]、柑橘[11]、花生[12]、菊花[13]、蘭花[14]、牡丹[15]和菠蘿[16]等作物的遺傳多樣性分析中。雖然國內(nèi)外陸續(xù)有人對木薯做了分子標(biāo)記研究，但尚未見SCoT分子標(biāo)記應(yīng)用于木薯種質(zhì)遺傳多樣性分析中的相關(guān)研究報(bào)道。

本文利用SCoT技術(shù)分析28份木薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以期通過該實(shí)驗(yàn)，彌補(bǔ)該技術(shù)在木薯中應(yīng)用的空白，并為木薯的親緣關(guān)系研究、資源鑒定及分子標(biāo)記輔助育種等提供新的可操作利用的分子標(biāo)記技術(shù)方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

本實(shí)驗(yàn)在廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試28份木薯種質(zhì)由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供（表1）。36條SCoT 引物序列參照Collard和Mackill（2009）文中所列[7]，由上海生工生物工程有限公司合成。DL 15 000 Marker、dNTPs、Taq DNA聚合酶等試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ? 2014年6月，在廣西農(nóng)科院建木薯育種基地，從編號材料采集自頂端起第三片展開葉，裝袋編號后放置冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室冰箱保存待提取DNA。DNA的提取參考改良CTAB提取法[17]。將提取好的DNA稀釋成50 ng/μL，放于-20 ℃攝氏度冰箱保存。

1.2.2 ?SCoT-PCR擴(kuò)增與檢測方法 ? PCR反應(yīng)在Bio-rad T100 Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行。采用20 μL PCR擴(kuò)增體系，其中包含10×PCR buffer（Mg2+）2.0 μL、引物0.6 μL（10 μmol/L）、dNTPs 2 μL（2.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶1.5 U、DNA 2 μL（30 ng/L），其余用滅菌的ddH2O補(bǔ)充。PCR程序設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸5 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠中電泳、GoldView核酸染色劑染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。使用的電泳儀為Bio-rad廠家生產(chǎn)的PowerPac universal，電泳槽為北京六一廠的DYCP-34A，設(shè)定電壓為120 V，運(yùn)行時(shí)間為80 min。

1.2.3 ?數(shù)據(jù)分析方法 ? SCoT產(chǎn)物按同一遷移水平下的條帶有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0，建立SCoT標(biāo)記的0、1矩陣。將矩陣輸入NTSYS-pc2.10e軟件中，計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并用不加權(quán)成對算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?SCoT擴(kuò)增結(jié)果分析

從36條SCoT引物中篩選出19條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物多介于250～2 500 bp之間（圖1）。19條引物共擴(kuò)增出171條帶，每條引物擴(kuò)增條帶數(shù)在5～16條之間，平均每條引物能擴(kuò)增出9條帶。每條引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)介于4～12條之間，平均每條引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶為6.5條，總體多態(tài)性條帶比率達(dá)71.9%。擴(kuò)增結(jié)果表明利用SCoT 標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增可檢測到較多的遺傳位點(diǎn)，擴(kuò)增條帶清晰分明，重復(fù)性好，表現(xiàn)出了豐富的多態(tài)性（表2）。

2.2 ?相似性分析

用NTSYS-pc2.10e軟件計(jì)算19條SCoT引物擴(kuò)增結(jié)果在28份木薯種質(zhì)之間的相似系數(shù)，得到相似性矩陣。華南205與南植199的相似系數(shù)最大，為 0.930;其次為NK-1與華南8號的遺傳相似系數(shù)，為0.924;新選048與華南10號的相似系數(shù)為0.860;相同來源的幾個(gè)材料相似系數(shù)較高，如NK-6與NK-7、NK-6與NK-3、NK-7與NK-3的相似系數(shù)分別為0.819、0.826、0.877，TAI27與TAI2、TAI8與TAI1的相似系數(shù)均為0.813;其余相似系數(shù)較高的種質(zhì)有TAI2與COL608的相似系數(shù)為0.836;TAI27與桂熱5號的相似系數(shù)為0.836;NK-6與新選048的相似系數(shù)為0.825;NK-10與新選048的相似系數(shù)為0.860。遺傳相似系數(shù)最低的是BRA354與CG1141-1，僅為0.631;COL22與BRA949的遺傳相似系數(shù)為0.637;TAI27與 BRA354的遺傳相似系數(shù)為0.655。

2.3 ?聚類分析

用NTSYS-pc2.10e軟件對19條引物標(biāo)記的171個(gè)遺傳位點(diǎn)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建28個(gè)木薯品種的聚類樹狀圖（圖2）。從圖2中可知，在相似系數(shù)0.68處，可將28份木薯種質(zhì)分為兩大類。第一類只包含一個(gè)材料，即BRA354，其余南植199等27份種質(zhì)歸為一類。在相似系數(shù)0.734的水平，可將第二大類的27份種質(zhì)分為4個(gè)亞組。第I亞組包括南植199、華南205、F520及NK-2 4份種質(zhì)。第II亞組含華南8號、NK-1、華南10號、新選048、NK-10、桂熱3號、BRA191、NK-3、NLK-7及NK-6 共10份種質(zhì)。第III亞組包括桂熱5號、TAI27、COL608、TAI2、TAI1、TAI3、CG1141-1、COL22、BRA1109、BRA1148及TAI8 共11份種質(zhì)。第IV亞組包括BRA949和COL304 共2份種質(zhì)。

3 ?討論與結(jié)論

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的評價(jià)已不再局限于形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及生化標(biāo)記，RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SRAP 及新近開發(fā)的 SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性的分析及評價(jià)[18]。RFLP、RAPD、SSR、ISSR及AFLP 4種標(biāo)記都是傳統(tǒng)意義上的隨機(jī)分子標(biāo)記，而 SRAP、SCoT標(biāo)記為目的基因分子標(biāo)記，得到的位點(diǎn)可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密聯(lián)鎖，更利于分子標(biāo)記輔助育種[19]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用SCoT技術(shù)分析了28份不同來源的木薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性，獲得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)中所參照的36條引物也被前人應(yīng)用于柑橘、菊花、牡丹等植物的SCoT擴(kuò)增，可見SCoT引物通用性強(qiáng)，可在不同物種中使用。本研究中篩選出的19條引物在28份木薯種質(zhì)中檢測出了豐富的遺傳多樣性，平均多態(tài)比率達(dá)71.9%，低于曾霞等[20]利用RAPD技術(shù)研究木薯遺傳背景的所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（多態(tài)性比率為83.9%），僅次于齊蘭等[6]利用SKAP標(biāo)記對木薯進(jìn)行分類鑒定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（多態(tài)性比率為73.4%），與夏秀忠[21]使用AFLP進(jìn)行木薯遺傳多態(tài)性研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)（多態(tài)性比率為71.7%）?？梢?，SCoT能檢測出一定程度的多態(tài)性，可滿足對木薯進(jìn)行遺傳多樣性檢測的需要。因此，可利用SCoT技術(shù)進(jìn)行木薯遺傳多樣性檢測及分子標(biāo)記輔助育種。

從聚類結(jié)果可以看出，分組具有一定的地域性，來源于同一國家或同一地區(qū)的種質(zhì)組成一組，但同一組中也包含不同國家地區(qū)的材料，如第III亞組含來自中國、泰國、哥倫比亞及巴西的材料。從品種來源看，在中國審定的桂熱5號品種即是從泰國大田作物研究中心引入的木薯品系編號Huay-Bong-60（R5×KU50的雜交后代），而泰國的很多品種也是從哥倫比亞國際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（CIAT）直接引進(jìn)或從引起材料后代選育而來。因此，由于木薯種質(zhì)資源引種交流頻繁，不同來源的資源間也存在交叉聚類的現(xiàn)象。來自同一地理位置材料的遺傳相似系數(shù)較高，而來自不同地理位置材料的遺傳相似系數(shù)普遍偏低，說明木薯的遺傳變化與地理區(qū)域的遠(yuǎn)近呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。在本實(shí)驗(yàn)的聚類結(jié)果中，BRA354單獨(dú)聚到了一類。經(jīng)查明，該木薯材料通用名是Mandiocaba，疑似為甜木薯品種，與其它栽培種可能存在較大的遺傳差異。在前人的研究中，華南205與南植199兩份材料并未聚在一起。而在本實(shí)驗(yàn)中，它們表現(xiàn)出高度相似的遺傳背景，可能原因在于，由于SCoT標(biāo)記是與性狀緊密聯(lián)系的標(biāo)記，2份材料在某些性狀上存在較高的相似性而聚在一起。另外，中國的木薯種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)較高，大部分達(dá)0.750以上，這與曾霞等[20]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)對中國44份木薯主要種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行分析的研究結(jié)果一致，說明中國木薯品種遺傳背景較為狹窄，遺傳多樣性還不夠豐富，還需進(jìn)一步增大引種力度，從其他地區(qū)引進(jìn)種質(zhì)資源，以豐富木薯種質(zhì)資源多樣性，提高遺傳改良潛力，為中國培育優(yōu)良品種木薯奠定良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] El-Sharkawy M A. Cassava biology and physiology[J]. Plant Molecular Biology， 2004， （56）： 481-501

[2] Balagopalan C. Cassava utilization in food， feed and industry[A]. In： Hillocks R J， Thresh J M， Bellotti A C（eds）. Cassava： biology， production and utilization[C]. CAB International， 2002： 301-318.

[3] Beeching J R， Marmey P， Gavdda M C， et al. An assess ment of genetic diversity with a collec-tion of cassava（mani hot esudenta Crantz）germplasm using molecular markers[J]. Annals of Botany， 1993， 72： 515-520.

[4] 鄒積鑫， 李開綿， 王文泉. 微衛(wèi)星分子標(biāo)記在木薯種質(zhì)資源遺傳分析中的應(yīng)用[J]. 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 11（2）： 1-5.

[5] 韋祖生， 夏志強(qiáng)， 李開綿. 木薯種質(zhì)庫遺傳多樣性的EST- SSR標(biāo)記[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2008， 29（3）： 304-309.

[6] 齊 ?蘭， 王文泉， 張振文， 等. 利用SRAP標(biāo)記構(gòu)建18個(gè)木薯品種的DNA指紋圖譜[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2010， 36（10）： 1 642-1 648.

[7] Collard B C Y， Mackill D J. Start codon targeted（SCoT）polymorphism： a simple， novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2009， 27（1）： 86-93.

[8] 陸才瑞， 喻樹迅， 于霽雯， 等. 功能型分子標(biāo)記（ISAP）的開發(fā)及評價(jià)[J]. 遺傳， 2008， 30： 1 207-1 216.

[9] Andersen J R， Lubberstedt T. ?Functional markers in plant[J]. Trends Plant Sci， 2003， 8： 554-560.

[10] 陳 ?虎， 何新華， 羅 ?聰， 等. 龍眼24個(gè)品種的SCoT遺傳多樣性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2010， 37（10）： 1 651-1 654.

[11] 韓國輝， 向素瓊， 汪衛(wèi)星， 等. 柑橘SCoT分子標(biāo)記技術(shù)體系的建立及其在遺傳分析中的應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2011， 38（7）： 1 243-1 250.

[12] 熊發(fā)前， 蔣 ?菁， 鐘瑞春， 等. 目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）分子標(biāo)記技術(shù)在花生屬中的應(yīng)用[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2010， 36（12）： 2 055-2 061.

[13] 李丕睿， 蔣甲福， 陳素梅， 等. 菊屬植物SCoT分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2013， 40（10）： 2 015-2 025.

[14] 高 ?嶺， 馮尚國， 何仁鋒， 等. 蘭屬植物目標(biāo)起始密碼子（SCoT）遺傳多樣性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2013， 40（10）： 2 026-2 032.

[15] 侯小改， 王 ?娟， 賈 ?甜， 等. 牡丹SCoT分子標(biāo)記正交優(yōu)化及引物篩選[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2011， 26（5）： 92-96.

[16] 陳香玲， 蘇偉強(qiáng)， 劉業(yè)強(qiáng)， 等. 36份菠蘿種質(zhì)的遺傳多樣性SCoT分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 25（2）： 625-62.

[17] 閆慶祥， 黃東益， 李開綿， 等. 利用改良CTAB法提取木薯基因組DNA[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2010， 26（4）： 30-32.

[18] 賈巧君， 朱靖環(huán)， 汪軍妹， 等. 浙江赤霉病抗性不同的大麥地方品種遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2013， 14（3）： 472-478.

[19] 蔣曉梅， 黃琳凱， 張新全， 等. 利用SCoT分析柳枝稷遺傳資源的多樣性[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2014， 15（1）： 89-95.

[20] 曾 ?霞， 莊南生， 李開綿. 應(yīng)用RAPD技術(shù)對44份木薯材料遺傳背景的研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2003， 24（2）： 59-64.

[21] 夏秀忠. 木薯品種的AFLP和SSR遺傳多態(tài)性研究[D]. 南寧： 廣西大學(xué)， 2005.