李敬 趙慶生 周偉杰 趙士豪

摘 ?要 ?以藍(lán)莓為材料，利用超聲強(qiáng)化法提取藍(lán)莓多糖。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法考察超聲功率、提取時(shí)間、液固比對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響。得到最優(yōu)提取工藝條件為： 超聲功率600 W，超聲時(shí)間 87 min，液固比49 mg/g，在此條件下，藍(lán)莓多糖提取率理論值為4.93%，驗(yàn)證實(shí)測(cè)值為4.91%，與預(yù)測(cè)值接近，說明該試驗(yàn)方案可行。

關(guān)鍵詞 ?藍(lán)莓;多糖;超聲強(qiáng)化;響應(yīng)面分析

中圖分類號(hào) ?S663.9 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Polysaccharides from Blueberries by Response Surface Analysis

LI Jing1*， ZHAO Qingsheng2， ZHOU Weijie3，ZHAO Shihao1

1 ?College of Biology Science and Engineering， Hebei University of Economics and Business， Shijiazhuang， Hebei 050061， China

2 ?National Key Laboratory of Biochemical Engineering， Institute of Process Engineering，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China

3 ?Huangdao Food and Drug Administration， Qingdao， Shandong 266555， China

Abstract ?In the present study， the conditions for ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from blueberries were optimized by response surface analysis. On the basis of single-factor experiments， the relationship between main extraction conditions including ultrasonic power， water to solid ratio and extraction time were modeled using a 3-factor， 3-level Box-Behnken experimental design. The established model was analyzed by response surface methodology to obtain the optimum extraction conditions. The optimum conditions of the ultrasonic wave extraction of blueberries polysaccharides were as follows： extraction ultrasonic power of 600 W， water to solid ratio 49 mg/g and extraction time of 87 min. The predictive maximum yield of blueberries polysaccharides was 4.93%. The average validation value was 4.91%. The optimized technology was stable and viable.

Key words Blueberries;Polysaccharides;Nltrasonic extraction;Response surface methodology

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.022

藍(lán)莓（Vaccinium uliginosum），又稱越橘果、越橘、藍(lán)漿果，為杜鵑花科越橘屬（Vacctnium）落葉或常綠灌木，是多年生的漿果類果樹。藍(lán)莓果肉細(xì)膩，風(fēng)味獨(dú)特，酸甜適口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他水果，堪稱“世界漿果之王”。因其具有較高的保健價(jià)值而風(fēng)靡世界，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）推薦的五大健康水果之一。藍(lán)莓含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，VA、VE、超氧化物歧化酶（SOD）等。此外，藍(lán)莓的微量元素含量也很高，鮮果中含鈣、磷、鎂、鋅、鐵、鍺、銅等[2]。除含有常見的營(yíng)養(yǎng)成分外，藍(lán)莓果實(shí)中還富含熊果苷、花青苷[3-4]、多酚[5]、胡蘿卜素、類黃酮、多糖[6]等。Mattila等[7]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓果皮每100 g含酚酸為85 mg。Bere[8]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓含有人體必須脂肪酸亞麻油酸，含量約0.25 g/100 g，脂肪則占0.75 g/100 g。不僅具有良好的營(yíng)養(yǎng)保健作用，還具有較強(qiáng)的抗癌作用[9]、保護(hù)心腦血管[10]以及輔助治療糖尿病[11]等功效。

目前， 藍(lán)莓多糖研究國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，本研究采用超聲提取法分離藍(lán)莓中的多糖成分，為藍(lán)莓多糖的生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗(yàn)材料：藍(lán)莓（藍(lán)豐，采收自北京懷柔）。

儀器：電子分析天平FA2004（上海天平儀器廠），KQ-250DB 型超聲波儀（昆明市超聲儀器有限公司），8002型恒溫水浴控制器（余姚明偉儀表廠），CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司），RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司產(chǎn)品），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），F(xiàn)D-1冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），2802UV/VIS 分光光度計(jì)（尤尼科上海儀器有限公司）。

試劑：乙醇、濃硫酸、苯酚、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、溴化鉀等，所用試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純產(chǎn)品。

1.2 ?方法

1.2.1 ?多糖提取工藝流程 ? 精確稱取藍(lán)莓粉末→80%乙醇回流→離心→殘?jiān)稍铩曁崛　x心→收集上清液→濃縮→加入4倍體積95%乙醇→低溫靜置24 h→離心→沉淀→冷凍干燥→多糖

1.2.2 ?多糖含量測(cè)定 ? 采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖40 mg于500 mL容量瓶中，加水定容，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜止10 min，搖勻，室溫放置30 min后于490 nm測(cè)光密度，以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白，重復(fù)3次，求平均值，以橫坐標(biāo)為多糖濃度，縱坐標(biāo)為光密度值（OD），得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

藍(lán)莓多糖含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取多糖粉末，加水溶解，按照上述步驟測(cè)定并計(jì)算純多糖含量，每個(gè)樣品做3次。藍(lán)莓多糖提取率按照以下公式計(jì)算：

多糖提取率/%=■×100

1.2.3 ?單因素試驗(yàn) ? 分別以超聲功率、提取時(shí)間、液固比以及提取次數(shù)為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，考察各單因素對(duì)浸提液中水溶性多糖得率的影響。重復(fù)3次，求平均值。

超聲功率對(duì)多糖提取率的影響：固定提取時(shí)間、液固比，超聲功率分別設(shè)定為200、400、600、800、1 000 W。

超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響：固定液固比、超聲功率， 超聲時(shí)間分別設(shè)定為20、40、60、80、100、120、140 min。

液固比對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響：固定超聲功率、超聲時(shí)間，液固比分別設(shè)定為30、40、50、60、70 mL/g。

提取次數(shù)對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響：固定超聲功率、超聲時(shí)間、液固比，提取次數(shù)設(shè)定為1、2、3、4次。

1.2.4 ?Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) ? 基于單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.5 ?熱水提取 ? 為了對(duì)比超聲提取與熱水提取的差別，取適量藍(lán)莓，經(jīng)前處理，在80 ℃條件下，提取2 h，其他步驟同1.2.2，重復(fù)3次，求平均值。

1.2.6 ?多糖的紅外分析 ? ?取適量經(jīng)冷凍干燥的藍(lán)莓多糖與溴化鉀充分研磨，壓片，用紅外光譜儀于4 000～400 cm- 1波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ?超聲功率對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響 ? 由圖1可知，隨著超聲功率的增加，多糖提取率先升高后降低，多糖提取率降低的原因可能是超聲功率過高導(dǎo)致多糖降解所致。600 W時(shí)，提取率最高。因此，選取600 W作為下一步優(yōu)化的因素。

2.1.2 ?超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響 ? 由圖2可知，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取效率先升高后降低。原因可能在于時(shí)間過短，多糖提取不充分;待多糖充分提取之后，繼續(xù)增加提取時(shí)間，多糖在超聲作用下發(fā)生降解，因此多糖的得率不但沒有增加，反而降低。

2.1.3 ?液固比對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響 ? 液固比對(duì)多糖提取率具有重要影響，溶劑量大有利于多糖的擴(kuò)散，促使多糖快速進(jìn)入溶劑體系。由圖3可以看出，液固比對(duì)多糖提取率稍有影響，但不明顯，液固比在50 ∶ 1時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高值。

2.1.4 ?提取次數(shù)對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響 ? 由圖4可知，提取次數(shù)對(duì)多糖提取率影響不大。因此，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，藍(lán)莓多糖提取1次即可。

2.2 ?響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則，選取超聲功率、提取時(shí)間、液固比3個(gè)對(duì)藍(lán)莓多糖提取率影響顯著的因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

響應(yīng)面方案的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。對(duì)表2 數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行處理和分析，獲得藍(lán)莓多糖提取率（Y）對(duì)超聲功率、提取時(shí)間、液固比的二次多元回歸方程：

Y=4.77+0.13A+0.20B+0.21C-0.047AB-0.14AC+0.058BC-0.60A2-0.48B2-0.078C2

對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析見表3，模型p<0.01，此時(shí)回歸方差模型極其顯著，表明該試驗(yàn)方法可靠。方程失擬項(xiàng)不顯著，表明該回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好的擬合?；貧w系數(shù)R2=0.955 6>0.9，表明該模型相關(guān)度好?；貧w方程各項(xiàng)的方差分析表明，對(duì)多糖提取率影響大小順序?yàn)镃>B>A。

各因素之間的相互關(guān)系如圖5～7所示。由圖5可以看出，無論固定提取時(shí)間還是超聲功率，隨著另一變量的增加，多糖提取率都是先升高后降低，說明超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)多糖提取率影響較為明顯。由圖6～7可知，固定液固比因素，隨著超聲功率或提取時(shí)間的增加，多糖的提取率先升高后降低，而固定超聲功率或提取時(shí)間，增加液固比，多糖的提取率都是增加的，說明溶液體系的增大，多糖更容易溶解在液體中，同時(shí)受到超聲的破壞也不再顯著。

2.3 ?模型驗(yàn)證

根據(jù)結(jié)果，響應(yīng)面給出的多糖得率最優(yōu)方案為： 超聲功率598.82 W，超聲時(shí)間 87.16 min，液固比49.45 mg/mL。為了操作簡(jiǎn)便，方案修訂為超聲功率600 W，超聲時(shí)間 87 min，液固比49 mg/g，在此條件下，藍(lán)莓多糖提取率理論值為4.93%，驗(yàn)證實(shí)測(cè)值為4.91%，與預(yù)測(cè)值接近，驗(yàn)證了模型的正確性。

2.4 ?紅外分析

由圖8可知，超聲提取與熱水提取制備的多糖，在紅外圖譜結(jié)構(gòu)上差異不大;3 334 cm-1的吸收峰為O-H的伸縮振動(dòng)，1 103cm-1 ?吸收峰是仲碳-OH 的O-H 變角振動(dòng)引起;3 334cm-1、1 637cm-1、1 443cm-1、1 103cm-1 吸收峰均出現(xiàn)糖類典型特征的吸收峰，1 744 cm-1附近出現(xiàn)羰基的伸縮振動(dòng)峰，1 332 cm-1 的吸收峰為C=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)，表明含有酸性糖成分。

3 ?討論與結(jié)論

多糖廣泛存在于植物根、莖、葉及果實(shí)中，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒及輔助降血糖等多種生物活性。因此，植物多糖的提取及特性研究對(duì)其開發(fā)利用和臨床應(yīng)用具有重要意義。從植物中提取多糖的常見方法有熱水提取法、酸堿提取法和酶解提取法。這些方法都有一定的局限性，熱水提取法所需能耗較高， 而且在提取過程中， 加熱會(huì)導(dǎo)致多糖鏈的斷裂;酸堿提取法會(huì)將植物中的生物堿或酸性物質(zhì)一起提取出來，造成所提取的多糖純度低，還需要進(jìn)一步的純化;酶解提取法的不僅成本較高，同時(shí)也會(huì)將部分多糖降解，造成多糖提取率降低[12]。近年來多種新興技術(shù)應(yīng)用于多糖提取，例如：超聲、微波、超高壓輔助溶劑浸提和超臨界流體萃取等[13]。其中，超聲波屬于機(jī)械振動(dòng)波，其空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)能將植物多糖有效地從細(xì)胞內(nèi)部分離出來，而不破壞多糖的結(jié)構(gòu)，糖活性損失小。同時(shí)，超聲輔助提取技術(shù)還具有提取時(shí)間短、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[14]。楊芳等[15]研究板栗多糖的超聲提取，在最優(yōu)條件下，板栗多糖的提取率是傳統(tǒng)熱水提取法的2.23倍，時(shí)間縮短了1.5倍。

超聲提取過程是一個(gè)復(fù)雜的提取和傳質(zhì)過程。超聲提取過程中，最主要的影響因素為超聲功率，超聲時(shí)間和液固比[16]。本研究根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面分析方法，利用Design Expert 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析，以藍(lán)莓多糖提取率為指標(biāo)，得到了藍(lán)莓多糖提取率與超聲功率、提取時(shí)間和液固比的回歸模型。本研究結(jié)果表明，超聲功率對(duì)多糖提取率影響較為明顯，多糖提取率隨超聲功率的增加先增加后降低。這主要是因?yàn)檩^低的超聲功率范圍內(nèi)，提高超聲功率有利于破壞植物細(xì)胞壁和促進(jìn)提取溶液的傳質(zhì)，從而提高多糖提取率;當(dāng)超過某一臨界值時(shí)，超聲波產(chǎn)生的剪切力強(qiáng)度過高，反而引起多糖分子結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而導(dǎo)致多糖提取率下降[16]。魏明等[17]在米糠多糖的超聲提取過程中，多糖最佳提取功率為200 W，升高或降低超聲功率都會(huì)導(dǎo)致多糖提取率下降。不同來源的多糖最佳提取功率不同，F(xiàn)u等[18]研究超聲提取樺褐孔菌多糖，最佳提取功率為100 W。由于超聲法是利用超聲波的機(jī)械剪切作用來提取多糖，超聲時(shí)間過長(zhǎng)可致多糖分子結(jié)構(gòu)的改變，從而降低多糖的提取率及活性，因此超聲時(shí)間也是影響多糖提取率的一個(gè)重要因素[19]。液固比影響著植物顆粒與超聲場(chǎng)的接觸范圍、超聲波的輻射半徑及溶液黏度，在一定范圍內(nèi)提高液固比有助于提高多糖提取率[16]。但黃秀香等[20]發(fā)現(xiàn)當(dāng)液固比超過一定值時(shí)，半枝蓮多糖提取率達(dá)到最大值后開始下降。本研究最佳提取功率為600 W，最佳的超聲時(shí)間為87 min，最佳液固比為49 mg/g。在最優(yōu)條件下，藍(lán)莓多糖提取率理論值為4.93%，驗(yàn)證實(shí)測(cè)值為4.91%。經(jīng)驗(yàn)證該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)超聲法提取藍(lán)莓多糖的得率。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究藍(lán)莓多糖提供了應(yīng)用及理論基礎(chǔ)。

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