鈣蛋白酶系統(tǒng)對(duì)肌肉系水力的影響研究進(jìn)展

徐晨晨 羅海玲

摘 要：系水力是肉品質(zhì)評(píng)價(jià)過程中重要的指標(biāo)之一。大量的研究表明，系水力與宰后肌肉蛋白質(zhì)的降解有關(guān)，而鈣蛋白酶系統(tǒng)在此過程中起著重要的調(diào)控作用。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外關(guān)于鈣蛋白酶在肌肉系水力方面的研究，概述了系水力、鈣蛋白酶系統(tǒng)，及其鈣蛋白酶對(duì)系水力影響的可能作用機(jī)制，旨在為今后其在該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：鈣蛋白酶；鈣蛋白酶抑制蛋白；系水力；滴水損失；嫩度

Advance in Research on Calpain System Affecting Water Holding Capacity in Muscle

XU Chenchen， LUO Hailing

（State Key Laboratory of Animal Nutrition， College of Animal Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract： Water holding capacity （WHC） is an important indicator of meat quality evaluation process. At present a large number of researches indicate that water holding capacity has relation with post-mortem muscle protein degradation， and the calpain system plays an important role in this process. Referring to domestic and overseas research about the calpain system and WHC in muscle， the review describes WHC as well as the calpain system and its possible mechanisms in influencing WHC to provide a reference for further research in this field.

Key words： calpain； calpastatin； water holding capacity； drip loss； tenderness

中圖分類號(hào)：TS251.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201506001

肌肉由75%水、19%蛋白質(zhì)、3.5%的可溶性非蛋白以及2.5%的脂肪組成。其中19%的蛋白質(zhì)為其骨架成分。肌肉內(nèi)大部分水分存在于肌原纖維中及肌球蛋白粗纖絲和肌動(dòng)蛋白/原肌球蛋白細(xì)纖絲之間的間隙中，此間隙可發(fā)生3倍體積的變化，因此肌原纖維間隙中的水分含量變化遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)結(jié)合水分含量的變化。而肌肉的持水能力，也就是系水力又與蛋白質(zhì)水解存在一定的關(guān)系[1]。Lawson[2]研究認(rèn)為宰后僵直收縮過程中肌原纖維之間擠出的水分可能進(jìn)入肌原纖維和細(xì)胞膜之間的通道中，該通道是由于鈣蛋白酶的作用導(dǎo)致整合蛋白的降解。Mohrhauser等[3]研究認(rèn)為，牛肉在成熟過程中μ-鈣蛋白酶主要影響肌原纖維蛋白的降解。Wiklund等[4]研究得出，滴水損失與鈣蛋白酶抑制蛋白活性呈顯著負(fù)相關(guān)。隨著肉品質(zhì)研究的深入以及檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新，人們對(duì)鈣蛋白酶系統(tǒng)與肌肉嫩度的關(guān)系已做了大量工作，本文就鈣蛋白酶系統(tǒng)與系水力的關(guān)系及其機(jī)制進(jìn)行闡述，探討國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究，期望對(duì)肉品質(zhì)的研究提供參考依據(jù)。

1 肌肉系水力概述

肉的系水力是非常重要的指標(biāo)，不僅影響肉的外觀，而且影響煮制過程中的汁液損失和咀嚼時(shí)肉的多汁性。利用核磁共振分析，肌肉中主要存在結(jié)合水和自由水。肌肉中水分主要存在兩種形式：結(jié)合水和自由水。結(jié)合水在加工過程中非常重要，可加速脫水或凍后的復(fù)水干，但結(jié)合水受肌肉結(jié)構(gòu)或電荷變化的影響很小。肌肉的滴水損失是模擬生鮮肉在自然吊掛以及貯存銷售過程中水分的流失情況，能更準(zhǔn)確地反映肌肉在生產(chǎn)加工過程中的失水情況。伴隨滴水損失的產(chǎn)生實(shí)際是肌細(xì)胞內(nèi)色素、肌紅蛋白、營(yíng)養(yǎng)成分等損失的產(chǎn)生，滴水損失不但直接影響肌肉的外觀、嫩度和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還降低肌肉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。

2 鈣蛋白酶系統(tǒng)概述

鈣蛋白酶屬于一類復(fù)雜的Ca2+激活型蛋白酶家族。哺乳動(dòng)物橫紋肌中的鈣蛋白酶類包括鈣蛋白酶1、2、10和肌肉組織特異性同工酶鈣蛋白酶3。Kapper等[6]研究表明，細(xì)胞骨架蛋白水解影響滴水損失，一般骨架蛋白的降解實(shí)際為水分的儲(chǔ)存提供了更多的空間。

2.1 鈣蛋白酶

鈣蛋白酶（calpain，CAPN）被分離出的形式為鈣依賴半胱氨酸蛋白酶，廣泛分布在脊椎動(dòng)物的細(xì)胞中。鈣蛋白酶不能作用于肌動(dòng)蛋白或肌球蛋白本身，也就是說只能作用于Z線。根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)完全激活鈣蛋白酶所需Ca2+濃度的不同，可將其分為鈣蛋白酶Ⅰ（μ-calpain，CAPNⅠ）和鈣蛋白酶Ⅱ（m-calpain，CAPNⅡ）（圖1），前者激活所需Ca2+濃度為微摩爾級(jí)，后者激活所需Ca2+濃度為毫摩爾級(jí)。兩者均有兩個(gè)亞基構(gòu)成：30 kD小亞基和80 kD大亞基。兩種CAPN為同工酶，具有降解肌原纖維蛋白的作用。

肌原纖維降解時(shí)，μ-calpain激活時(shí)首先降解N2線的連接蛋白（Titin）和半肌動(dòng)蛋白（Nebulin），導(dǎo)致維肌原纖維I帶與Z盤之間的結(jié)合變?nèi)趸驍嗔?，從而使肌纖維釋放出的肌絲降解為小片段，釋放出的肌絲小片段被細(xì)胞溶酶體捕獲再進(jìn)一步降解。Huff-Lonergan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶系統(tǒng)引起肌原纖維收縮從而導(dǎo)致肌纖維蛋白的降解（如結(jié)蛋白）。Pomponio等[8]研究表明，在豬肉老化過程中，μ-calpain活性與肌原纖維蛋白的水解程度成正比。

2.2 鈣蛋白酶抑制蛋白

鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin，CAST）是一種天然的具有高度特異性的內(nèi)源抑制劑鈣蛋白酶，非溶酶體的胞內(nèi)蛋白酶，特異性的抑制μ-和m-鈣蛋白酶，但是迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)它有其他蛋白質(zhì)酶的水解活性。CAST是幾乎完全無(wú)規(guī)則卷曲的構(gòu)象，并且是非變性溶液的二聚體或四聚體，因?yàn)槭榛蛩徕c—聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上的鈣蛋白酶抑制蛋白制劑包含了比那些估計(jì)與大小排阻層析小得多的多肽。鈣蛋白酶抑制蛋白的cDNA編碼研究表明，鈣蛋白酶抑制蛋白多肽包括4 個(gè)重復(fù)域，每個(gè)輕微同源的（23%～36%）結(jié)構(gòu)域包括約140 個(gè)氨基酸，以及一個(gè)NH2-末端結(jié)構(gòu)域，稱為L(zhǎng)域。這些鈣蛋白酶抑制蛋白從68～78 kD不等，這取決于L域的大小。

鈣蛋白酶抑制蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)能夠阻止鈣蛋白酶結(jié)合到膜上，然后鈣蛋白酶降解肌間線蛋白，使α-肌動(dòng)素和Z-盤的結(jié)合變?nèi)趸蛘邤嗔?。且這種抑制作用并不受pH值的影響。Goll等[10]曾報(bào)道鈣蛋白酶抑制蛋白在SDS-PAGE上的異常緩慢遷移是鈣蛋白酶抑制蛋白多肽本身的屬性（圖2）。

3 鈣蛋白酶系統(tǒng)對(duì)肌肉系水力的作用機(jī)制

3.1 鈣蛋白酶的作用機(jī)制

很難將肉的成熟變化歸結(jié)于某個(gè)蛋白酶及其抑制劑，有學(xué)者進(jìn)行了模型研究。宰后剛開始，肉中Ca2+濃度很低，不足以激活CAPNⅠ；但是當(dāng)pH值下降至6.1左右時(shí)，Ca2+濃度增加，足以激活CAPN I。在屠宰后12 h內(nèi)，當(dāng)溫度從37 ℃下降到10 ℃，和成熟有關(guān)的各個(gè)參數(shù)迅速變化，并且在此期間，成熟期間的一半反應(yīng)已經(jīng)完成。隨著宰殺后體內(nèi)ATP逐漸耗盡，肌漿網(wǎng)失去了原有保留鈣離子的能力，使肌漿中鈣離子的濃度升高至10―6 mol/L以上，鈣蛋白酶活性加強(qiáng)，進(jìn)而被激活?；罨蟮拟}蛋白酶對(duì)肌纖維和骨骼肌蛋白進(jìn)行降解，降解后的蛋白質(zhì)對(duì)于維持肌肉完整性和肉質(zhì)嫩度有重要作用。

研究表明，鈣蛋白酶對(duì)肌肉的作用機(jī)制主要表現(xiàn)在3 個(gè)方面：1）鈣蛋白酶對(duì)連接蛋白和伴肌動(dòng)蛋白的降解，使肌原纖維I帶和Z盤結(jié)合變?nèi)趸驍嗔选?）對(duì)肌小節(jié)、結(jié)蛋白和細(xì)絲蛋白的降解。肌小節(jié)是肌纖維最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，在肌膜附近的肌原纖維每一I帶水平上都有分布，起著連接肌原纖維和肌膜的作用。肌原纖維間連蛋白有結(jié)蛋白和細(xì)絲蛋白，起著固定肌原纖維的作用，而它們的降解，則導(dǎo)致肌原纖維的有序結(jié)構(gòu)被破壞，從而對(duì)肌肉嫩度產(chǎn)生促進(jìn)作用。3）對(duì)肌鈣蛋白（troponin）的降解。肌鈣蛋白有鈣結(jié)合亞基（TnC）、抑制亞基（TnI）和原肌球蛋白結(jié)合亞基（TnT）組成。肌鈣蛋白T（相對(duì)分子質(zhì)量30 000，由259 個(gè)氨基酸殘基組成）與原肌球蛋白和肌鈣蛋白C結(jié)合，只能被磷酸化酶b激酶磷酸化。但是，肌鈣蛋白T的降解程度可以指示肌肉成熟過程的進(jìn)度，但其他因素也必須考慮。

Kristensen等[11]認(rèn)為宰后成熟過程中，紐蛋白和肌間線蛋白發(fā)生緩慢降解，而踝蛋白發(fā)生緩慢降解，使骨骼肌膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，使肌肉的系水力降低。Jalango等[12]研究發(fā)現(xiàn)肌肉流失的汁液中主要是肌漿蛋白質(zhì)。Lametsch等[13]報(bào)道，通過電離質(zhì)譜法鑒定豬肉背最長(zhǎng)肌發(fā)現(xiàn)，肌肉蛋白的降解與一些結(jié)構(gòu)蛋白（肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、和肌鈣蛋白-T）有關(guān)。Tait 等[14]通過遺傳標(biāo)記研究證明，CAPN1 和CAST對(duì)牛肉保水力有重要作用。

3.2 鈣蛋白酶抑制蛋白的作用機(jī)制

鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）可抑制肌肉內(nèi)蛋白質(zhì)降解，是肌肉蛋白質(zhì)降解的限速步驟。是通過抑制鈣蛋白酶的活性而影響肉的嫩度，在大多數(shù)組織中其濃度足以抑制鈣蛋白酶的活性。

鈣蛋白酶抑制蛋白多肽編碼和cDNA的表達(dá)說明每個(gè)結(jié)構(gòu)域：第I、II、III和IV（圖2），可以抑制的μ-或m-鈣蛋白酶活性。第L域沒有抑制活性。各個(gè)域的抑制能力不同：I域>IV域>III域>II域。大鼠的鈣蛋白酶抑制蛋白（缺乏XL域和外顯子3）抑制μ-鈣蛋白酶比m-鈣蛋白酶更有效，但這種差異是由去磷酸化產(chǎn)生的。不同物種間鈣蛋白酶抑制蛋白結(jié)構(gòu)域在其抑制μ-或m-鈣蛋白酶能力會(huì)有顯著的差異。另有研究表明，CAST在宰后肌肉中也會(huì)發(fā)生降解，并且降解后同樣抑制鈣蛋白酶的活性[15]。

CAST基因的表達(dá)與雞肉肌纖維的生成有顯著相關(guān)性[16]。Giusti等[17]研究發(fā)現(xiàn)印度內(nèi)洛爾牛CAST基因的表達(dá)可以反映牛肉的品質(zhì)和韌性。Casas等[18]曾報(bào)道，對(duì)牛肉CAST和CAPN1基因進(jìn)行酶標(biāo)記得出，CAST和CAPN1基因與牛肉嫩度有顯著相關(guān)性。肌肉的系水力是反映肌肉嫩度的一個(gè)重要指標(biāo)，因此可以把 CAST 基因作為影響肉質(zhì)性狀特別是肌肉系水力的候選基因。

4 影響鈣蛋白酶活性離子因素

4.1 Ca2+

CaCl2是Ca2+主要添加來源，在肌肉中加入Ca2+能使鈣蛋白酶最大限度的被激活，并且不同物種鈣激活酶結(jié)構(gòu)包括活性調(diào)節(jié)部位不同。Koohmaraie[19]于1989年最早提出向肌肉中加入Ca2+這種嫩化技術(shù)。注射10% CaCl2，6 min后可以顯著改善牛肉顏色、滴水損失和蒸煮損失[20]。飼糧中缺乏NaCl時(shí)，添加大量CaCl2可以降低牛肉背最長(zhǎng)肌的系水力和蛋白質(zhì)溶解度[21]。用75 mmol/L CaCl2溶液進(jìn)行腌漬時(shí)，牛肉嫩度提高，但是有苦味[22]。因此，可以認(rèn)為Ca2+是通過激活鈣蛋白酶系統(tǒng)來改善肌肉系水力。

4.2 焦磷酸鈉（NaPPi）

焦磷酸鹽具有較強(qiáng)的緩沖作用和持水能力， NaPPi 含有多個(gè)陰離子，顯堿性，能緩沖肉中pH值降低趨勢(shì)，提高肉成熟過程中pH值和離子強(qiáng)度，這些結(jié)果均可促進(jìn)calpain的激活。焦磷酸鹽（在1% NaCl條件下）的作用是解聚肌動(dòng)球蛋白，分解為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，形成肌球蛋白單聚體，該作用與ATP有關(guān)。宰后的肉中注射NaPPi可加速鈣蛋白酶的活化，改善肉品質(zhì)[23]，而肌肉中注射NaCl 也和注射NaPPi一樣，均可以提高肌肉嫩度，離子強(qiáng)度是改善嫩度的主要原因。

5 與鈣蛋白酶有關(guān)的CaN-NFAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

CaN（鈣調(diào)磷酸酶）是NF-AT的（活化的T細(xì)胞的核因子）轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的基因，一旦鈣調(diào)磷酸酶去磷酸化，NF-AT轉(zhuǎn)錄因子會(huì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并直接激活免疫應(yīng)答的基因，在Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[24]。高濃度的鈣離子可以激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和活化T細(xì)胞核因子，在細(xì)胞核內(nèi)活化T細(xì)胞核因子依賴于鈣離子來誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的應(yīng)答，但是細(xì)胞內(nèi)的鈣離子不足以完成此過程，因此，需要鈣釋放性鈣通道維持持續(xù)的鈣平臺(tái)濃度。

該信號(hào)途徑能夠調(diào)節(jié)不同纖維類型的表達(dá)，同時(shí)鈣蛋白酶抑制蛋白與不同纖維基因表達(dá)也有著密切的關(guān)系。因此，鈣蛋白酶與CaN-NFAT信號(hào)通路的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。英國(guó)諾丁漢大學(xué)通過對(duì)豬背最長(zhǎng)肌CAST基因的表達(dá)推測(cè)得出，β-興奮劑克倫特羅對(duì)鈣蛋白酶抑制蛋白基因表達(dá)的調(diào)控與CaN-NFAT信號(hào)途徑相關(guān)[25]。

6 結(jié) 語(yǔ)

肌肉的系水力與蛋白質(zhì)的持水能力有關(guān)，因此在生產(chǎn)中可以試圖增加某些飼料添加劑激活鈣蛋白酶或降低鈣蛋白酶抑制蛋白活性，以此來控制汁液的流失，提高肌肉的感官品質(zhì)。鈣蛋白酶系統(tǒng)對(duì)系水力的更具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。因此，利用分子生物學(xué)等技術(shù)手段進(jìn)行深入研究鈣蛋白酶系統(tǒng)與系水力之間的關(guān)系具有重要意義，為開發(fā)新型、安全、有效的肉質(zhì)添加劑提供理論依據(jù)。

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