盧培培

摘 ?要：本鑒定旨在探討SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)穿心蓮種子進(jìn)行鑒別的可行性，為穿心蓮種子鑒別及育種研究提供科學(xué)依據(jù)。本鑒定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)幾種不同來(lái)源和不同采收期的穿心蓮種子進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)電泳研究。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地的穿心蓮種子蛋白質(zhì)電泳圖譜之間在譜型和譜帶的強(qiáng)弱、蛋白質(zhì)相對(duì)含量上均有一定的差異，不同采收期穿心蓮種子蛋白質(zhì)電泳在蛋白質(zhì)譜帶的強(qiáng)弱上有一定差異。結(jié)論是聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)可用于穿心蓮種子鑒定。

關(guān)鍵詞：聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù) ?穿心蓮 ?種子鑒定

穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees為爵床科植物，具有清熱解毒、涼血消腫等功能，臨床上常用于急性菌痢、胃腸炎、感冒、流腦、氣管炎、高血壓等疾病的治療。研究表明，不同產(chǎn)地、不同采收期的穿心蓮性狀、成分差異較大，種子混雜現(xiàn)象也較嚴(yán)重。中藥材種子所含蛋白質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量攜帶了其長(zhǎng)期演化的遺傳特征，具有很高的穩(wěn)定性和專(zhuān)屬性，其真?zhèn)魏推贩N鑒別是中藥集約化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)和前提。1991年國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)將蛋白質(zhì)電泳方法正式定為標(biāo)準(zhǔn)的品種鑒定方法。目前，蛋白質(zhì)電泳技術(shù)迅速發(fā)展和日臻完善，但大多應(yīng)用于玉米、棉花等植物中，應(yīng)用于藥用植物的研究尚為數(shù)不多。鑒定收集了幾種不同產(chǎn)地和不同采收期的穿心蓮種子，利用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，旨在為穿心蓮種質(zhì)資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)，種子的鑒定及育種提供參考依據(jù)。

一、鑒定的材料與方法

1.材料。采集4個(gè)不同地區(qū)和同一地區(qū)3種不同采收期的成熟穿心蓮果實(shí)，室溫下陰干，待果皮自然裂開(kāi)彈出種子，收集于種子瓶中置室溫陰涼處保存。

2.儀器與試劑。鑒定所用儀器：DYY-11型電泳儀，DYCZ-24DN雙垂直平電泳槽，TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)、HK3300H超聲波清洗器，PHS-30酸度計(jì)，HC-TP12-2型架盤(pán)藥物天平。鑒定所用試劑：甘油，1%（質(zhì)量濃度）溴酚藍(lán)，考馬斯亮藍(lán)R-250染液（取0.04 g考馬斯亮藍(lán)R-250，加入甲醇18 mL、蒸餾水18 mL和冰醋酸4 mL，即得），考馬斯亮藍(lán)脫色液（10 mL甲醇、10 mL冰醋酸和80 mL蒸餾水混勻），30%（質(zhì)量濃度，下同）丙烯酰胺，0.8%N，N-甲叉雙丙烯酰胺，10%SDS，10%過(guò)硫酸銨，1%溴酚藍(lán)。

3.方法

3.1 樣品緩沖液的制備取1 mol·L-1的Tris-HCl 0.6 mL，加入50%（體積分?jǐn)?shù)）的甘油5 mL、10%（體積分?jǐn)?shù)）的SDS 2 mL、 2-硫基乙醇0.5 mL、1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溴酚藍(lán)1 mL和蒸餾水0.9 mL，4 ℃冰箱中存放，備用。

3.2 丙烯酰胺儲(chǔ)存液100 mL（A液）30%丙烯酰胺、0.8%雙丙烯酰胺。

3.3 ?4×分離膠緩沖液100 mL（B液）2 mol·L-1Tris-HCl 75 mL、10%SDS 4 mL，蒸餾水21 mL。

3.4 ?4×濃縮膠緩沖液100 mL（C液）取1 mol·L-1 Tris-HCl 50 mL，加入10%SDS 4 mL，再加入蒸餾水46 mL，即得。

3.5 ?5%濃縮膠蒸餾水2.3 mL，A液0.67 mL，C液1.0 mL，10%過(guò)硫酸銨30 μL，TEMED 5 μL。

3.6 ?12%分離膠A液4 mL，B液2.5 mL，蒸餾水3.5 mL，10%過(guò)硫酸銨50 μL，TEMED 5 μL。

3.7樣品溶液的制備[8]取穿心蓮種子0.5 g，加入稀釋5倍的樣品緩沖液（pH6.8）2 mL，3%聚乙烯毗咯烷酮（PVP），冰浴下研磨，加入稀釋4倍的5%濃縮膠緩沖液1 mL，振搖，混勻，超聲20 min，室溫離心20 min（4 000 r·min-1）。取上清液，離心20 min（4 000 r·min-1）， 取上清液， 加入石油醚 2 mL，振搖2 min，靜止分層。吸取下層液體，加入適量冷丙酮，振搖，置4 ℃冰箱30 min，取出，離心5 s（4 000 r·min-1），棄去丙酮，風(fēng)干。沉淀物加入樣品緩沖液2～3 mL，振搖2 min，超聲5～10 min，待溶解完全后，室溫下離心5 min（4 000 r·min-1），取上清液，置4 ℃冰箱中存放，備用。

3.8 電泳緩沖液的配制取Tris堿3 g、甘氨酸14.4 g和SDS 1 g， 加入蒸餾水至1 L， pH 8.3， 在 4 ℃冰箱中存放，備用。

3.9 電泳操作采用1 mm厚的SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度12%，電極緩沖液為T(mén)ris-甘氨酸，pH8.3。用微量注射器分別取樣品液25 μL，注入樣品槽底部，點(diǎn)樣結(jié)束后向上槽內(nèi)加入1滴溴酚藍(lán)指示劑示蹤。起始電壓控制在120 V，樣品進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)整為200 V，待指示劑距前沿約1 cm時(shí)，停止電泳，迅速取出膠板，標(biāo)記前沿。

3.10 染色和脫色取出膠板后，用蒸餾水沖洗，隨即放入考馬斯亮藍(lán) R250顯色液中，置恒溫箱中38 ℃染色2 h 后取出，多次更換脫色液（甲醇10 mL、冰醋酸10 mL和蒸餾水80 mL），至背景清晰為止。拍照、記錄。

二、鑒定結(jié)果與分析

1.電泳結(jié)果不同產(chǎn)地和不同采收期的穿心蓮種子蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果制成圖表，根據(jù)此繪制成電泳圖譜。結(jié)果顯示，不同來(lái)源、同一產(chǎn)地不同采收期的穿心蓮種子可溶性蛋白質(zhì)電泳圖譜共有11條共有特征帶，且譜帶清晰，Rf值分別為：0.460、0.471、0.482、0.495、0.512、0.524、0.538、0.825、0.921、0.937，表示其具有的共同遺傳基礎(chǔ)，可作為鑒定穿心蓮種子的重要標(biāo)記。以一級(jí)帶、二級(jí)帶作為主要分析特征，不同產(chǎn)地及不同采收期的穿心蓮種子蛋白質(zhì)譜帶具有多條共同譜帶，但白云基地采收種子的電泳譜帶數(shù)目與其他種子有較大差異，有10條特征帶。在三級(jí)帶、四級(jí)帶和五級(jí)帶上，一些譜帶的數(shù)目、遷移率有一定差異。

2.蛋白相對(duì)百分含量為了分析蛋白表達(dá)量，利用凝膠圖像分析軟件Band Scan對(duì)電泳蛋白圖譜進(jìn)行分析，其中由于有部分譜帶的灰度值太低，難以測(cè)出其所在區(qū)域的蛋白含量?？蓽y(cè)得的目的蛋白占總蛋白的百分?jǐn)?shù)結(jié)果較為復(fù)雜。a～f.分別是編號(hào)為a～f的穿心蓮種子，穿心蓮種子可溶性蛋白電泳圖譜顯示清晰，穿心蓮種子可溶性蛋白電泳圖譜分析圖結(jié)果表明，不同來(lái)源地和不同采收期的穿心蓮種子蛋白表達(dá)量亦存在差異。

三、討論

穿心蓮?fù)ǔＪ欠N子繁殖，故種子的鑒定及其品質(zhì)極為重要。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)產(chǎn)物，具有一定的穩(wěn)定性，但亦會(huì)受環(huán)境的影響而發(fā)生基因的變異，形成不同的生態(tài)型甚至變種。本研究首次利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)4個(gè)不同來(lái)源地的穿心蓮種子及同一產(chǎn)地不同采收期的穿心蓮種子水溶性蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)電泳的初步研究。研究結(jié)果表明，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)可作為鑒定穿心蓮種子的生物指征。此外，同一來(lái)源不同采收期的穿心蓮種子蛋白質(zhì)電泳圖譜在譜帶數(shù)目、遷移率上具有較高相似性，在蛋白質(zhì)相對(duì)含量上則呈現(xiàn)出一定的差異，提示可以作為穿心蓮種子成熟以及最佳采收期的生化標(biāo)記，相關(guān)的研究將在下一步工作開(kāi)展。為穿心蓮種子可溶性蛋白電泳的蛋白表達(dá)量提供了數(shù)據(jù)。本研究表明了利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)穿心蓮種子進(jìn)行鑒定及種子品質(zhì)研究的可行性，為進(jìn)一步研究穿心蓮種質(zhì)資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)及育種提供參考依據(jù)。