杜永慶

[中圖分類(lèi)號(hào)] S858 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1003-1650 （2015）10-0167-02

前言：近年來(lái)，隨著養(yǎng)雞業(yè)的迅猛發(fā)展，雞大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率也不斷增加，現(xiàn)已成為危害養(yǎng)殖業(yè)的最為危害之一。 目前細(xì)菌性疾病的防治主要依靠抗菌素和疫苗制品，但由于細(xì)菌血清型差異變化較大、抗菌素長(zhǎng)期超大劑量使用、耐藥菌株產(chǎn)生等原因，導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的防治效果下降，因而在臨床上需不斷選取敏感性藥物才能達(dá)到防治細(xì)菌性疾病的目的增多腹膜，有灰白色滲出物。目前大腸桿菌對(duì)抗生素容易產(chǎn)生耐藥性，氟苯尼考與多西環(huán)素連用對(duì)雞大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)觀察其，聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果，為臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 方法

1.1 細(xì)菌分離

無(wú)菌采集死雞的肝臟，肺臟等組織。接種到普通瓊脂平板上在溫箱中37℃培養(yǎng)20h。涂片革蘭氏染色后鏡檢。挑取表面光滑，邊緣整齊，灰白色半透明的單個(gè)小菌落劃線接種于麥康凱瓊脂平板，于37？℃培養(yǎng)20？h。

1.2 生化試驗(yàn)

將純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖等生化試驗(yàn)管內(nèi)37℃培養(yǎng)20h種到普通肉湯當(dāng)中放進(jìn)溫箱37？℃培養(yǎng)20h，涂片，用革蘭氏染色后鏡檢，挑觀察結(jié)果

1.3 菌液制備

將分離出來(lái)菌釣取單個(gè)菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)20h放到4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥敏試驗(yàn)

1.4.1用天枰稱(chēng)取0.07g氟苯尼考原粉放入小玻璃瓶中用無(wú)菌蒸餾水稀釋后放入濾紙片并浸濕。貼上標(biāo)簽放入恒溫箱留作配用。

1.4.2稱(chēng)取0.07g多西環(huán)素原粉放入小玻璃瓶中用無(wú)菌蒸餾水稀釋后放入濾紙片并浸濕。貼上標(biāo)簽放入恒溫箱留作配用。

1.4.3稱(chēng)取氟苯尼考多西環(huán)素各0.07g放入小玻璃瓶中用無(wú)菌蒸餾水混勻稀釋后放入濾紙片并浸濕。貼上標(biāo)簽放入恒溫箱留作配用。

1.4.4將培養(yǎng)皿清洗干凈用牛皮紙包好放在高壓滅菌鍋里滅菌15min，取出后放入干燥箱內(nèi)干燥，放入恒溫箱備用。

1.4.5制作營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板： 稱(chēng)取蛋白胨10g、牛肉膏5g、Nacl 5g、瓊脂15g、500ml的蒸餾水放入燒杯中，放入微波爐里直至溶解，取出牛皮紙封口用繩扎緊放在高壓鍋內(nèi)滅菌15min。滅菌后取出將瓊脂倒入培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)使其均勻，瓊脂凝固后涂病料。

1.4.6接種： 取出接種環(huán)燒去多余菌體，待接種環(huán)冷去挑取雞大腸桿菌的單個(gè)菌落稍稍打開(kāi)培養(yǎng)皿從接種細(xì)菌的部位從左向右輕輕劃線，劃線完畢皿蓋。在已接完種的平板底壁中心及四周貼上標(biāo)簽寫(xiě)上藥物名稱(chēng)，在用鑷子夾取制備好的藥片貼在瓊脂平板的上與所寫(xiě)藥名的位置對(duì)應(yīng)，最后放入恒溫箱中20h后觀察.

藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直勁， 15 mm≤d<20 mm為高敏， 10 mm≤d<15 mm為中敏， d<10 mm為低敏。

2 最小抑菌濃度測(cè)定

2.1 氟苯尼考體外抑菌

2.1.1 藥物原液稀釋

用電子天平稱(chēng)取0.07g藥物，用無(wú)水乙醇滴加震蕩至完全溶解，以蒸餾水容到50ml，無(wú)菌操作將藥物溶解稀釋1280ug/ml。

2.1.2 稀釋菌液

用營(yíng)養(yǎng)肉湯做1：100倍稀釋?zhuān)缓笤?支無(wú)菌加塞試管中加入稀釋后的菌液，在第一個(gè)管中加入稀釋后的菌液1.8ml其余各管均加入1ml。

2.1.3 加入抗菌藥物

做2倍遞進(jìn)稀釋?zhuān)瑢缇蟮脑嚬芊旁谠嚬芗苌线M(jìn)行試驗(yàn)操作，在第一試管內(nèi)加入抗菌藥物原液0.2ml，混合后用移液管吸出1ml加入第2個(gè)試管中，用同樣的方法依次稀釋至第7個(gè)試管中棄去1ml。第8管為生長(zhǎng)對(duì)照37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)后觀察結(jié)果凡無(wú)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥液濃度為該藥單用時(shí)的MIC。

2.2 多西環(huán)素體外抑菌

2.2.1 藥物原液稀釋

用電子天平稱(chēng)取0.08g藥物，用無(wú)水乙醇滴加震蕩至完全溶解，以蒸餾水容到50ml，無(wú)菌操作將藥物溶解稀釋1280ug/ml。

2.2.2 稀釋菌液

用營(yíng)養(yǎng)肉湯做1：100倍稀釋?zhuān)缓笤?支無(wú)菌加塞試管中加入稀釋后的菌液，在第一個(gè)管中加入稀釋后的菌液1.8ml其余各管均加入1ml。

2.2.3 加入抗菌藥物

做2倍遞進(jìn)稀釋?zhuān)瑢缇蟮脑嚬芊旁谠嚬芗苌线M(jìn)行試驗(yàn)操作，在第一試管內(nèi)加入抗菌藥物原液0.2ml，混合后用移液管吸出1ml加入第2個(gè)試管中，用同樣的方法依次稀釋至第7個(gè)試管中棄去1ml。第8管為生長(zhǎng)對(duì)照37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)后觀察結(jié)果凡無(wú)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥液濃度為該藥單用時(shí)的MIC。

2.3 聯(lián)合用藥

2.3.1 藥物原液稀釋

分別稱(chēng)取兩種藥物原粉，用蒸餾水混合定容到50ml。

2.3.2 稀釋菌液

用營(yíng)養(yǎng)肉湯做1：100倍稀釋?zhuān)缓笤?支無(wú)菌加塞試管中加入稀釋后的菌液，在第一個(gè)管中加入稀釋后的菌液1.6ml其余各管均加入1ml。

2.3.3 加入抗菌藥物

分別將兩種藥液0.2ml加入第一個(gè)試管中，用二倍遞進(jìn)稀釋法，直到稀釋至第7個(gè)試管中棄去1ml。第8管為生長(zhǎng)對(duì)照37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)后觀察結(jié)果凡無(wú)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥液濃度為該藥單用時(shí)的MIC。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果： 氟苯尼考對(duì)雞大腸桿菌的敏感度比多西環(huán)素敏感度高。聯(lián)合用藥時(shí)為高度敏感.氟苯尼考與多西環(huán)素合用對(duì)雞大腸桿菌的最小抑菌濃度為1ug/ml表示兩藥合用為累加作用。

4 討論

雞大腸桿菌是一種條件性病原微生物，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降，特別是應(yīng)急的情況下細(xì)菌的致病性即可表現(xiàn)出來(lái)使感染的雞發(fā)病。本病常成為某些傳染病的并發(fā)病或繼發(fā)病。

單藥的體外抗菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌對(duì)氟苯尼考已經(jīng)出現(xiàn)耐藥性這說(shuō)明如果在生產(chǎn)中繼續(xù)使用單藥，將很難起到殺菌作用，而且會(huì)使細(xì)菌耐藥性進(jìn)一步增強(qiáng)。治療需要，當(dāng)敏感菌低水平耐藥后必須增大用藥劑量，如果用藥不規(guī)范就會(huì)造成藥物在體內(nèi)大量蓄積。藥物蓄積濃度越高，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的速度越快，治療時(shí)用藥量就越大，這樣就形成惡性循環(huán)，氟苯尼考與多西環(huán)素合用呈累加作用. 兩藥聯(lián)合可大大減少氟苯尼考的用量減少了用藥成本，同時(shí)大幅度增強(qiáng)殺菌效果。

藥敏實(shí)驗(yàn)表明氟苯尼考與多西環(huán)素合用對(duì)大腸桿菌敏感度為高度敏感。測(cè)得單藥的最小抑菌濃度與聯(lián)合用藥的最小抑菌濃度表明，聯(lián)合用藥為累加作用。聯(lián)合用藥組的抑菌作用比單獨(dú)用藥高。