路明華 劉俊生 劉延亭 張希娟 王忠輝 張二磊 侯艷紅

摘要：使用國產(chǎn)BC-7L生物反應器對BHK-21細胞懸浮培養(yǎng)參數(shù)進行了初步研究。通過對培養(yǎng)液血清含量、pH、溶氧和攪拌轉(zhuǎn)速逐一進行優(yōu)化研究，最終確定了BHK-21細胞懸浮培養(yǎng)的最佳參數(shù)為：血清濃度為5%，pH為7.40、DO為50%，攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min。

關(guān)鍵詞：生物反應器；BHK-21細胞；懸浮培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)在生物技術(shù)和生物醫(yī)藥研究中已得到了廣泛的應用。近幾十年來，隨著生物工程和組織工程學的發(fā)展，相應的生物反應器水平也在不斷提高，現(xiàn)已研制出多種不同用途、型號的動物細胞生物反應器，其性能也日趨完善，種類越來越多，規(guī)模越來越大，在國外，已放大到5000 -10000L。懸浮培養(yǎng)技術(shù)最大優(yōu)勢是通過更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時能穩(wěn)步提高產(chǎn)品的質(zhì)量。由于動物細胞在懸浮培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件要求很高，不易達到最佳生長狀態(tài)，故本研究對生物反應器懸浮培養(yǎng)BHK-21細胞的培養(yǎng)條件進行了研究，以期使BHK-21細胞達到最佳生長狀態(tài)，為后續(xù)規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

BHK-21細胞，新生牛血清（四季青），DMEM（GBICO），NaHC03，消泡劑。

1.2 儀器設備

BC-7L生物反應器，為廣州齊志生物工程設備有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 BHK-21懸浮細胞制備取BHK-21貼壁細胞種進行復蘇，待細胞長滿單層并生長狀態(tài)良好時，用0.25%胰酶消化，之后用移液管輕輕吹打成單個細胞懸浮液，以0.5×106個/mL的密度接種300-1000mL搖瓶中，于90r/min恒溫搖床培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)5代后，進行上罐培養(yǎng)。

1.3.2 血清含量對懸浮細胞培養(yǎng)的影響將搖瓶BHK-21細胞以0.5×106個/mL的密度接種至5生物反應器中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中血清含量分別調(diào)整2%、5%、10%三個濃度進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中對各濃度細胞取樣計細胞數(shù)并觀察細胞形態(tài)。

1.3.3 培養(yǎng)液pH對懸浮細胞培養(yǎng)的影響在保持其它培養(yǎng)條件不變的情況下，分別設置DMEM培養(yǎng)液pH為7.0-7.2、7.2-7.4、7.4-7.6、7.6-7.8進行平行實驗。37℃培養(yǎng)48h后，取樣進行細胞計數(shù)并觀察細胞形態(tài)。

1.3.4 培養(yǎng)液溶氧（DO）對懸浮細胞培養(yǎng)的影響在保持其它參數(shù)不改變的情況下，分別設置溶氧為40%、50%、60%、70%、80%，同樣培養(yǎng)48h后取樣計細胞數(shù)并觀察細胞形態(tài)。

1.3.5 攪拌轉(zhuǎn)速對懸浮培養(yǎng)細胞的影響在同樣其它的參數(shù)條件下，只通過改變攪拌的轉(zhuǎn)速來觀察，轉(zhuǎn)速對細胞形態(tài)的影響。分別設置轉(zhuǎn)速為40r/min、70r/min、100r/min。

2 結(jié)果

2.1 血清含量對懸浮BHK-21生長的影響

對三個血清濃度下培養(yǎng)的細胞進行取樣觀察和細胞計數(shù)結(jié)果顯示：2%血清濃度下，細胞生長極其緩慢，細胞密度顯著低于另外兩組；血清濃度為5%時，細胞生長良好，細胞密度顯著高于2%組，但略低于10%血清濃度；10%血清濃度組，細胞生長好，細胞數(shù)最多。

2.2 培養(yǎng)液pH對懸浮BHK-21生長的影響

pH在一定小范圍內(nèi)變化，對細胞生長并不會產(chǎn)生大的影響，但如果變動幅度較大，則會造成細胞生長緩慢，狀態(tài)不好。實驗結(jié)果顯示pH為7.4時，細胞生長最佳。

2.3

DO對懸浮BHK-21生長的影響

溶氧低，不足以維持細胞生長，溶氧高會增加02通入量，造成生產(chǎn)成本提高。從實驗結(jié)果分析，50%的溶氧效果最好。

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速對BHK-21生長的影響

40r/min條件下，轉(zhuǎn)速不足以提供足夠的力量使細胞懸浮起來，觀察到反應器底部沉積了較多的細胞；將轉(zhuǎn)速提高至70r/min，細胞雖然不會再沉積到反應器底部，但是取樣觀察發(fā)現(xiàn)有較多的細胞聚集成團；繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速至100r/min，細胞聚團情況得到解決，細咆生長良好。100r/min為最佳攪拌轉(zhuǎn)速。

3 結(jié)論與分析

1）實驗過程中，發(fā)現(xiàn)搖瓶轉(zhuǎn)接生物反應器的時候，細胞密度不可過低，從本實驗結(jié)果顯示，如果當細胞密度低于2×105個/mL時，細胞生長則十分緩慢，有資料顯示如果培養(yǎng)基與細胞的容積比例大于2000：1，生長物質(zhì)彌散到細胞外過多，將使細胞內(nèi)濃度低于最小限度的濃度，此時細胞不能再增殖，培養(yǎng)基的pH值變堿，抑制細胞生長，甚至引起細胞死亡等。

2）雖然血清濃度為10%時，細胞數(shù)高、狀態(tài)好，但是與血清濃度為5%時相比，差異并不太大，綜合考慮生產(chǎn)成本，應選擇血清濃度為5%為最佳血清濃度。另外，所使用的血清質(zhì)量也會影響細胞的生長狀態(tài)，一般質(zhì)量較好的血清在融化后呈透明、淡黃色，并且無支原體、病毒及其它微生物污染。血清濃度高有利于細胞分裂，細胞生長較快，但是高濃度的血清成分比較復雜，對后續(xù)的純化不利，且價格較高，質(zhì)量不穩(wěn)定，因此選擇開發(fā)和使用低血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基成為未來的需求。

3）細胞聚集成團對細胞生長狀態(tài)具有嚴重影響。如果結(jié)團嚴重，處于細胞團中間的細胞則會吸收營養(yǎng)物質(zhì)不足，生長速度降低，從而引起細胞蛋白結(jié)構(gòu)改變等一系列問題，使得細胞表達能力下降。一方面，提高攪拌速度可以改善細胞結(jié)團的情況，但較高的攪拌速度也會對細胞產(chǎn)生一定的影響，如果可以開發(fā)一種抑制細胞結(jié)團的試劑，勢必將大大促進懸浮細胞的培養(yǎng)。