類風濕關節(jié)炎實驗動物模型研究綜述

陳哲　郭艷幸

【摘 要】 類風濕關節(jié)炎動物模型一直是研究的重點，提供與人類風濕關節(jié)炎類似的動物模型，有助于深入研究本病的發(fā)病機制和治療策略。然而，不同的動物模型特點也不盡相同，應根據(jù)實驗需求選擇合適的模型。通過整理目前國內(nèi)外類風濕關節(jié)炎模型研究，綜述幾種常用的實驗性類風濕關節(jié)炎模型的建立方法、發(fā)病機制和特點，以期為類風濕關節(jié)炎的深入研究及防治提供依據(jù)。

【關鍵詞】 關節(jié)炎，類風濕；動物模型；實驗；綜述

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.12.019

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜的持續(xù)增生、軟骨及骨破壞的病理學特征為主的自身免疫性疾病，主要以慢性炎癥、多發(fā)關節(jié)腫脹、疼痛及其引起的關節(jié)僵硬，甚至功能喪失為臨床表現(xiàn)[1]。其病因和發(fā)病機制尚不明了。本文對幾種常用的類風濕關節(jié)炎模型的建立、發(fā)病機制及特點做一綜述，為更好地研究其機制以及尋求防治方法提供依據(jù)。

1 佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型

AA是比較經(jīng)典的RA動物模型[2]。弗氏佐劑包括不完全佐劑（incomplete Frennd' adjuvant，IFA）

和完全佐劑（Freund's complete adjuvant，CFA）。

CFA是將減毒卡介苗（BCG）10 mg經(jīng)80 ℃水浴滅活1 h，與高壓滅菌的液體石蠟和無水羊毛脂的混合液1 mL充分乳化混勻制成。此法多用大鼠。

1.1 造模方法 在消毒后的大鼠足跖皮下注入已經(jīng)乳化混勻的CFA，濃度為10 mg·mL-1，每側注射0.1 mL。原發(fā)病變主要是注射部位的炎癥表現(xiàn)，踝關節(jié)及足跖部紅腫，可侵及足墊、全足。繼發(fā)病變則呈現(xiàn)對側踝關節(jié)和前足腫脹，呈不斷加重趨勢，耳朵和尾根部出現(xiàn)“關節(jié)炎”結節(jié)，這些表現(xiàn)與人RA類似[3]。病理改變表現(xiàn)為關節(jié)周圍及軟組織的炎癥，可造成滑膜增生，血管翳形成，軟骨破壞，后期關節(jié)間隙變窄，關節(jié)粘連，以致形成不可逆的改變。

1.2 發(fā)病機制 AA的發(fā)病機制主要為分子模擬理論。關節(jié)軟骨的自身抗原Hsp60與結核桿菌中一個相對分子量為65 ku熱休克蛋白（Hsp65）結構高度相似，可以通過分子模擬或交叉反應，被同一株T細胞克隆識別，進一步引起自身的免疫反應[4]。有研究表明，T淋巴細胞免疫功能異常在RA的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。AA造模成功后，檢測指標中CD3+、CD4+、CD8+下降，CD4+/CD8+升高，表現(xiàn)有明顯的免疫功能紊亂現(xiàn)象，提示T細胞亞群紊亂是AA大鼠的病理機制之一[5]。另一方面，細胞因子在AA發(fā)病的免疫調(diào)節(jié)中也起著核心的作用[6]。有研究證實，AA的發(fā)病過程中有氧化應激反應發(fā)生[7]，發(fā)病過程中產(chǎn)生大量的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）[8]。Stoop等[9]研究表明，佐劑的選擇可影響Th1和Th17細胞的總比例，而不一定影響細胞因子的產(chǎn)生以及疾病的發(fā)生率和嚴重的水平。

1.3 特 點 AA模型制備方法簡單易行，在臨床表現(xiàn)、病理學及免疫學上與人RA有很多相似之處，所以被普遍應用于RA相關研究。但AA缺乏慢性病理過程，與RA的病變過程不盡相同。如只用AA模型研究RA，局限性較大，所以，還需要參照其他模型從多個方面綜合考慮。

2 膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）

模型

1977年，Trentham等[10]根據(jù)動物可被Ⅱ型膠原誘導產(chǎn)生免疫性關節(jié)炎這一理論，初次成功建立了由Ⅱ型膠原誘導的大鼠實驗性關節(jié)炎模型。該模型隨著研究的深入進一步發(fā)展和完善，目前造模動物多選用SD或Wistar大鼠、DBA/l或C57BL/6

小鼠。

CIA模型是一種免疫炎癥模型，主要表現(xiàn)為多發(fā)性末端關節(jié)炎。通過抗原刺激引起自身免疫反應誘導關節(jié)炎產(chǎn)生，并形成抗CⅡ抗體，且可持續(xù)發(fā)展，并且更加符合人類疾病特點，包括關節(jié)紅腫、滑膜增生、炎性細胞浸潤、血管翳形成、關節(jié)軟骨和骨破壞等，與RA臨床表現(xiàn)更相似，是研究以及篩選治療RA藥物的理想模型。

2.1 造模方法 以DBA/1小鼠為例，首先將CⅡ（Ⅱ型膠原）溶于0.1 mol·L-1的醋酸中，濃度為2 g·L-1，在4 ℃環(huán)境中過夜后與等量CFA充分乳化，制得CⅡ乳劑（即每毫升含1 mg CⅡ和1 mg BCG），可于冰上配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。免疫時，在小鼠尾根部、背部多點進行皮內(nèi)注射0.1 mL，21 d后，對每只小鼠進行腹腔內(nèi)注射CⅡ乳劑0.1 mL，達到加強免疫的目的。

CIA模型具有典型的多發(fā)性關節(jié)炎表現(xiàn)，Zhang等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在致炎后24 d左右出現(xiàn)關節(jié)紅腫，最早出現(xiàn)癥狀的是后足踝關節(jié)，隨后發(fā)展到前足和尾部并呈持續(xù)性加重，最終導致關節(jié)畸形。36 d左右最嚴重，病理變化為增生性滑膜炎，關節(jié)腔內(nèi)有炎性細胞浸潤，并有豐富的血管翳形成，關節(jié)軟骨及軟骨下骨質(zhì)均受到侵蝕和破壞，這些臨床表現(xiàn)及病理學改變與RA密切相關。但CIA在同種屬、同周齡、相同誘發(fā)因素和生活環(huán)境下，發(fā)病時間相差較大，臨床表現(xiàn)輕重不一。CIA關節(jié)炎發(fā)病率比單獨使用CFA注射顯著提高。

2.2 發(fā)病機制 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該模型建立的主要原因是CⅡ在免疫系統(tǒng)的高敏感性[13]。CIA的機制主要通過體液及細胞免疫完成，依靠于自身

T細胞和B細胞的激活。有研究發(fā)現(xiàn)，CIA的發(fā)生和發(fā)展主要由Th1、Th2這兩種T細胞共同調(diào)節(jié)，正常狀態(tài)下處于平衡狀態(tài)，而初次免疫和加強免疫后小鼠外周血出現(xiàn)Th1/Th2亞群失衡狀態(tài)[14]。此外有研究表明，IL-1β、TNF-α在CIA模型建立過程中起重要的誘導作用，且在病變過程中血清

IL-1β、TNF-α水平持續(xù)升高[15-16]。

2.3 特 點 CIA模型與人RA的相似之處包括易侵犯肢體遠端關節(jié)、關節(jié)滑膜增生、血管翳形成、軟骨與骨的破壞，以及免疫反應等。目前，CIA是公認的RA最佳模型，在免疫學、治療效果評價及藥物篩選等方面的研究中，CIA模型為研究者提供了極大幫助。但是，CIA是在一定實驗條件下形成的疾病，不會出現(xiàn)病情的波動和復發(fā)情況，以及類風濕因子和抗核抗體，也沒有RA的皮下結節(jié)、漿膜炎、血管炎等表現(xiàn)，這表明CIA仍有一些不足之處，仍然需要繼續(xù)探索更加符合RA特征的動物模型。

3 卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的關節(jié)炎模型

1962年由Dumonde和Glynn首次建立[17]。OVA作為一種外源性抗原已被廣泛運用于主動致敏建立如支氣管哮喘等病的動物模型[18]。

3.1 造模方法 用生理鹽水溶解OVA配成濃度為20 mg·mL-1的溶液，與等量CFA混勻，在動物肩胛部及背部5個部位皮下注射，每周1次，連續(xù)注射3周，第4周于雙膝關節(jié)腔內(nèi)注入OVA 5 mg[19]。

3.2 發(fā)病機制 OVA在關節(jié)內(nèi)作為抗原長期存在，刺激滑膜產(chǎn)生抗體并形成抗原-抗體-C3復合物，激活補體造成局部滑膜炎癥反應。另一方面，T細胞引起的免疫反應，使炎性細胞浸潤于滑膜，使血管翳逐步形成，進而出現(xiàn)軟骨及骨破壞[20-21]。

3.3 特 點 該模型方法簡單，易制備，適合較大病變關節(jié)的研究，比如兔、羊等動物。其病理過程與人RA相似，但免疫學指標有一定的差異，因此該模型有其局限性。

4 Ⅱ型膠原抗體誘導性關節(jié)炎（collagen-antibody-

inducedarthritis，CAIA）

CAIA是抗體誘導性關節(jié)炎模型中較常用的模型之一，多采用C57BL/6小鼠，通過注射Ⅱ型膠原抗體誘導模型的發(fā)生，后期注射脂多糖以增加疾病的發(fā)生率及嚴重程度。該模型被用來研究基因、年齡、性別，以及效應細胞在關節(jié)炎終末階段的發(fā)病機制中的影響。發(fā)病部位組織學檢查發(fā)現(xiàn)大量中性粒細胞浸潤，伴隨著骨與軟骨的侵蝕，血管翳形成以及纖維蛋白沉積。

研究表明，CAIA的發(fā)生與MHC等位基因相互獨立，而CIA則主要依賴于MHC等位基因，其中Aq分子是最易感的等位基因之一。這表明，CAIA與MHC限制性T細胞以及T細胞依賴性

B細胞無關[22]。

5 自發(fā)性關節(jié)炎模型

轉基因動物是指將外源重組基因整合在動物受體基因組內(nèi)，將其遺傳給后代的動物。常用的轉基因動物模型有K/BxN模型、人TNF-α轉基因模型、IL-1Ra基因敲除小鼠模型、SKG模型、TS1×HA CⅡ模型等。

5.1 K/BxN小鼠模型 K/BxN小鼠模型是KRN轉基因小鼠（攜帶有TCR基因）與非肥胖糖尿?。╪on-obese diabetes，NOD）小鼠雜交的后代[23]。在3周齡左右，小鼠可出現(xiàn)對稱性關節(jié)炎，最開始表現(xiàn)為關節(jié)腫脹，進一步發(fā)展為關節(jié)損傷、畸形（遠端關節(jié)表現(xiàn)最明顯）；組織病理學表現(xiàn)為滑膜及血管增生，血管翳形成，軟骨及骨破壞等。

該模型血清中存在大量自身抗體，可造成關節(jié)破壞。其主要發(fā)病機制是T細胞受體可特異性識別自身葡萄糖-6-磷酸異構酶（glueose-6-phosphate-isomearse，GPI），導致針對GPI的自身抗體（anti-GPI）分泌增加。該抗體屬于致病性抗體，從而誘導小鼠發(fā)展為RA。GPI在體內(nèi)還可同時誘導T細胞、B細胞產(chǎn)生抗體，導致關節(jié)及軟骨損

害[24]。另有研究表明，NOD小鼠的MHC-II（I-Ag7）基因與KRN轉基因小鼠關節(jié)炎的發(fā)生密切相關，說明K/BxN小鼠模型受到MHC-II類分子的限制。此外，補體通過替代途徑的激活以及Fc受體在K/BxN小鼠關節(jié)炎的發(fā)病中同時具有重要作用。該模型主要針對研究RA中自身抗體的作用。

5.2 人TNF-α轉基因模型 1991年Probert等通過修飾3'端的UTR區(qū)域，使C57B L/6小鼠高表達人TNF-α，從而建立此模型[25]。小鼠在4周左右可出現(xiàn)自發(fā)性慢性炎癥，主要表現(xiàn)為對稱性關節(jié)炎、血管翳增生、關節(jié)軟骨及骨破壞等，這些都與RA臨床表現(xiàn)相似，同時還可有小腸透壁性炎癥，生長緩慢等癥狀。病理表現(xiàn)主要為大量纖維組織增生、軟骨損傷及骨質(zhì)溶解；新骨形成的缺乏和生長發(fā)育遲緩也見于這些小鼠，可能是由鈣穩(wěn)態(tài)受損與腸道對鈣吸收的減少而造成。該模型成模率100%，且模型的同質(zhì)性高，并有利于衡量TNF-α抑制劑相比其他治療方法的優(yōu)勢，表明TNF-α抑制劑的作用取決于病變初始階段，可明顯減輕

損害[26]。

5.3 IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）基因敲除小鼠模型 IL-1是由多種細胞類型產(chǎn)生的促炎細胞因子，包括活化的單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和滑膜細胞，這些都是在RA中導致關節(jié)炎癥及破壞的重要因素。天然存在的IL-1Ra對限制過度的炎癥反應有至關重要的作用。IL-1Ra缺失突變（敲除）小鼠與BALB/c小鼠的后代自發(fā)形成關節(jié)炎，其病變類似于RA，表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤、滑膜細胞增殖、血管翳形成、軟骨破壞與骨質(zhì)溶解，還有關節(jié)中類風濕因子以及IL-6、TNF-α等炎癥因子表達升高。與人RA相比，在IL-1Ra基因敲除小鼠模型中T細胞的作用同樣是關節(jié)炎發(fā)病機制的核心[27]。

5.4 SKG模型 SKG小鼠是通過選擇具有隱形突變基因的BALB/c小鼠交配培育出來的自發(fā)關節(jié)炎模型，其病理機制主要通過T細胞介導，小鼠在

8周左右即出現(xiàn)對稱的足趾及踝關節(jié)腫脹，呈慢性進行性發(fā)展，后期多發(fā)生關節(jié)強直[28]。關節(jié)外的病變可表現(xiàn)為肺炎、皮炎和淋巴結節(jié)，其表現(xiàn)與RA類似，適合研究RA發(fā)展與T細胞的關系。研究表明，SKG模型的發(fā)生發(fā)展與TCR Vβ2和Vβ8.2的T細胞克隆型關系密切[29]。

5.5 TS1×HACⅡ模型 將HATⅡ轉基因小鼠與TS1小鼠交配培育的后代可自發(fā)關節(jié)炎，其機制為TS1小鼠通過轉基因能夠表達針對HACⅡ小鼠產(chǎn)生流感病毒PR8 HA特異性的TCR，主要表現(xiàn)為長期的關節(jié)腫脹，關節(jié)外病變表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎。研究表明，TS1×HACⅡ模型是由CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg細胞）細胞識別新的自身抗原通過全身性分布的抗原呈遞細胞表達的?？梢?，CD4+

CD25+Treg細胞在預防自身免疫性疾病中發(fā)揮關鍵作用[30]。

除此以外，還有油誘導的關節(jié)炎、鏈球菌誘導的關節(jié)炎、佐劑角叉菜膠誘導的關節(jié)炎、蛋白多糖誘導的關節(jié)炎等，這些模型目前運用較少，主要應用于某一方面的研究，尚不夠成熟，仍需進一步的研究觀察[31]。

在對RA動物模型的長期研究過程中，隨之發(fā)展的是對RA病因及發(fā)病機制的進一步認識。但是仍存在一些問題：①RA動物模型均是在一定實驗條件下，針對某單一方面的因素建立起來的，不能全面反映RA遺傳、感染、免疫等特點；②不同的RA動物模型，其發(fā)病機制和病理特點的異同有待進一步闡釋；③RA動物模型中一些指標如關節(jié)腫痛、晨僵、發(fā)熱等不適不能夠被客觀地體現(xiàn)出來，因此模型評價標準仍需完善。綜上所述，探尋一種能完全符合RA特點的動物模型仍是今后的重中之重。

6 參考文獻

[1] Haleagrahara N，Swaminathan M，Chakravarthi S，et al.

Therapeutic efficacy of vitamin E δ-tocotrienol in collagen-induced rat model of arthritis[J].Biomed Res Int，2014：539540.

[2] Jacobson PB，Borgan SJ，Wilcox DM，et al.A new spin on an old model：In vivo evaluation of disease progression by magnetic resonance imaging with respect to standard inflammatory parameters and histopathology in the adjuvant arthritic rat[J].Arthritis Rheum，1999，42（10）：2060-2073.

[3] Pottier G，Bernards N，Dollé F，et al.DPA-714 as a biomarker for positron emission tomography imaging of rheumatoid arthritis in an animal model[J].Arthritis Res Ther，2014，16（2）：R69.

[4] 陳尹，魏偉，吳虹，等.木瓜苷對佐劑性關節(jié)炎大鼠血清抗體水平的下調(diào)作用[J].中國藥理學通報，2007，23（7）：941-944.

[5] 李慧玲，鄔劍，斗章，等.佐劑性關節(jié)炎大鼠細胞免疫功能的變化[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2011，34（2）：82.

[6] 田俊閣，盧偉偉，平立峰.中藥對佐劑性關節(jié)炎大鼠細胞因子影響的研究進展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2009，18（30）：3774-3776.

[7] Bauerova K，Acquaviva A，Ponist S，et al.Markers of inflammation and oxidative stress studies in adjuvant-induced arthritis in the rat on systemic and local level affected by pinosylvin and methotrexate and their combination[J].Autoimmunity，2015，48（1）：46-56.

[8] Lin B，Zhao Y，Han P，et al.Anti-arthritic activity of Xanthium strumarium L.extract on complete Freund's adjuvant induced arthritis in rats[J].J Ethnopharmacol，2014，155（1）：248-255.

[9] Stoop JN，Tibbitt CA，van Eden W.The choice of adjuvant determines the cytokine profile of t cells in proteoglycan-induced arthritis but does not influence disease severity[J].Immunology，2013，138（1）：68-75.

[10] Trentham DE，Townes AS，Kang AH.Autoimmunity to type II collagen an experimental model of arthritis[J].J Exp Med，1977，146（3）：857-867.

[11] Zhang LL，Liu YJ，Tong T，et al.Establishing method and evaluation indexes of collagen-induced arthritis model in DBA/1 mice[J].Chin Pharmacol Bull，2010，26（8）：1108-1111.

[12] Xu JX，Zhang Y，Zhang XZ，et al.Anti-angiogenic effects of genistein on synovium in a rat model of type Ⅱ collagen-induced arthritis[J].Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2011，9（2）：186-193.

[13] Trentham DE，Townes AS，Kang AH.Autoimmunity to type Ⅱ collagen an experimental model of arthritis[J].J Exp Med，1977，146（3）：857-866.

[14] 陳秋華，唐培，謝彤，等.嗜堿性粒細胞在膠原誘導性關節(jié)炎模型小鼠Th1/Th2應答失衡中的作用[J].中國比較醫(yī)學雜志，2014，24（6）：7-11.

[15] Karatas A，Koca SS，Ozgen M，et al.Pemetrexed Ameliorates Experimental Arthritis in Rats[J].Inflammation，2015，38（1）：9-15.

[16] 王鋼，王麗琴，王佳，等.秦艽醇提物對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠血清抗-CCP 及TNF-α的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（19）：302-305.

[17] Brackertz D，Mitchell GF，Mackay IR.Antigen-induced arthritis in mice.I.Induction of arthritis in various strains of mice[J].Arthritis Rheum，1977，20（3）：841-850.

[18] Ra J，Lee S，Kim HJ，et al.Bambusae Caulis in Taeniam

extract reduces ovalbumin-induced airway inflammation

and T helper 2 responses in mice[J].J Ethnophar-macol，2010，128（1）：241-247.

[19] 胡吳斌，胡玲，唐照亮，等.類風濕關節(jié)炎實驗動物模型研究與評述[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2011，31（9）：1290-1293.

[20] 孫莉莉，周酈楠.類風濕性關節(jié)炎動物模型的研究進展[J].中國實用醫(yī)藥，2011，6（24）：244-245.

[21] Glynn LE.The chronicity of inflammation and its sig

nificance in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，1968，27（7）：105-121.

[22] Nandakumar KS，B?cklund J，Vestberg M，et al.Collagen type Ⅱ （CⅡ）-specific antibodies induce arthritis in

the absence of T or B cells but the arthritis progression is enhanced by CⅡ-reactive T cells[J].Arthritis Res Ther，2004，6（6）：544-550.

[23] Buttgereit F，Zhou H，Kalak R，et al.Transgenic disruption of glucocorticoid signaling in mature osteoblasts and osteocytes attenuated K/BxN mouse serum-induced arthritis in vivo[J].Arthritis Rheum，2009，60（7）：1998-2007.

[24] Schubert D，Maier B，Morawietz L，et al.Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice[J].J Immunol，2004，172（7）：4503-4509.

[25] Li J，Zhou Q，Wood RW，et al.CD23（+）/CD21（hi）B-cell translocation and ipsilateral lymph node collapse is associated with asymmetric arthritic flare in TNF-Tg mice[J].Arthritis Res Ther，2011，13（4）：R138.

[26] Wipke BT，Wang Z，Nagengast W，et al.Staging the initiation of autoantibody-induced arthritis：a critical role for immune complexes [J].J Immunol，2004，172（12）：7694-7702.

[27] Caplazi P，Baca M，Barck K，et al.Mouse Models of Rheumatoid Arthritis[J].Vet Pathol，2015，52（5）：819-826.

[28] Duarte J，Agua-Doce A，Oliveira VG，et al.Modulatione of IL-17 and foxp3 expression in the prevention of autoimmune arthritis in mice[J].PLoS One，2010，5（5）：e10558.

[29] Baillet AC，Rehaume LM，Benham H，et al.High Chlamydia Burden Promotes Tumor Necrosis Factor-Dependent Reactive Arthritis in SKG Mice[J].Arthritis Rheumatol，2015，67（6）：1535-1547.

[30] Yu Q，Xu M，Yu F，et al.CD4+CD25+ regulatory T cells as a therapeutic target in rheumatoid arthritis[J].Cent Eur J Immunol，2014，39（1）：100-103.

[31] Nagate T，Tamura T，Sato F，et al.Tranilast suppresses the disease development of the adjuvant-and streptococcal cell wall-induced arthritis in rats[J].J Pharmacol Sci，2007，105（1）：48-56.

收稿日期：2015-05-28；修回日期：2015-09-07