錢芳　張芹

【摘要】目的：用高效液相色譜法測(cè)定黃蜀葵花總黃酮中金絲桃苷的含量。方法：色譜柱：依利特-C-18-柱（250×4.6 mm，5μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm，柱溫：30℃。結(jié)果：金絲桃苷在11.4059～364.99μg/ml范圍內(nèi)與峰面積的積分值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=1.0000），平均加樣回收率97.14%，RSD1.86%（n=6）。結(jié)論：HPLC法簡(jiǎn)便易行、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于測(cè)定黃蜀葵花總黃酮中金絲桃苷含量。

【關(guān)鍵詞】黃蜀葵花總黃酮；HPLC法；金絲桃苷

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）23-0014-02

黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬黃蜀葵（Abelmoschus manihot L·Medic）的干燥花。黃蜀葵花含豐富的黃酮類化合物，可用于治療缺血性心臟病和缺血性腦血管病。黃蜀葵花總黃酮對(duì)缺氧損傷、急性心肌缺血具保護(hù)作用，并對(duì)不完全缺血性腦損傷有一定的保護(hù)作用[1-4]。有研究表明，主要由金絲桃苷為主的黃酮醇苷及其苷元組成黃酮類成分[5]。文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道的金絲桃苷的含量測(cè)定方法多為等度HPLC法，對(duì)于黃蜀葵花中金絲桃苷的有效分離檢測(cè)不易實(shí)現(xiàn)。本試驗(yàn)將梯度HPLC法用于測(cè)定黃蜀葵花總黃酮中金絲桃苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Agilent1100，G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314A VWD檢測(cè)器，Agilent ChemStation，美國(guó)安捷倫公司；1/10萬(wàn)電子分析天平：BP-211D型，德國(guó)Sartorius；超聲波清洗器：KQ-1000E，江蘇昆山超聲儀器公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-1A型，江蘇南通市滬通制藥機(jī)械設(shè)備公司；數(shù)顯型恒溫水浴鍋：HH-4，江蘇金壇榮華儀器公司。

1.2 試藥 金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)111521-201205），中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)買，含量測(cè)定用； 黃蜀葵花總黃酮（批號(hào)141009、141010、141011），本實(shí)驗(yàn)室制備；液相色譜所用試劑：色譜純；水：超純水；其它試劑：分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特C-18-柱（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫：0～35min（16∶84），35～37min（30∶70）， 37～53min（30∶70），53～55min（16∶84），55～60min（16∶84）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量10μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品，精密稱定，甲醇溶解制成1ml含729.98μg的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取黃蜀葵花總黃酮100mg，置于25ml量瓶中，加入甲醇，超聲30min，放冷，再加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取供試品溶液、對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μl，在上述液相色譜梯度洗脫條件下，液相色譜圖中，金絲桃苷達(dá)基線分離，理論板數(shù)按金絲桃苷計(jì)在10000以上，分離度大于2.0。（見圖1）

2.4 線性關(guān)系考察 取上述對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋至364.99、182.495、91.2475、45.6238、22.8119、11.4059μg/ml，在高效液相色譜儀中，注入不同濃度的對(duì)照品溶液10μl，測(cè)定。經(jīng)線性回歸，得金絲桃苷回歸方程y=21.93x+27.36，r=1.0000，金絲桃苷在11.4059～364.99μg/ml范圍內(nèi)，同峰面積的積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 同一對(duì)照品溶液，精密吸取10μl后，注入液相色譜儀，重復(fù)測(cè)定6次，以峰面積計(jì)算，RSD為0.58%（n=6）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，RSD為0.84%（n=6），結(jié)果表明：供試品溶液12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（141009）的黃蜀葵花總黃酮，約100mg，共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，測(cè)定，以金絲桃苷含量計(jì)算，RSD為1.21%（n=6）。結(jié)果表明，重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 根據(jù)加樣回收率試驗(yàn)的要求，取已知含量的黃蜀葵花總黃酮（141009）約50mg，共6份，精密稱定后，加入金絲桃苷對(duì)照品，依法制備供試品溶液，液相色譜儀中注入精密吸取的10μl，測(cè)定，計(jì)算，平均回收率為97.14%，RSD為1.86%。

2.9 樣品含量測(cè)定 取3批黃蜀葵花總黃酮，每批2份，根據(jù)上述方法，制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算結(jié)果如下。見表2。

3 討論

試驗(yàn)中曾參考藥典[9] ：以乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）為流動(dòng)相，結(jié)果分離效果不好，又嘗試乙腈-0.1%磷酸溶液，不同比例等度洗脫系統(tǒng)，金絲桃苷未能有效分離，且分析時(shí)間過長(zhǎng)。通過反復(fù)試驗(yàn)，最后以乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～35min（16∶84），35～37min（30∶70）， 37～53min-（30∶70）-，53～55min（16∶84），55～60min（16∶84），實(shí)現(xiàn)了較好的分離效果。

HPLC法測(cè)定黃蜀葵花總黃酮中金絲桃苷含量簡(jiǎn)便易行、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于其質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2015.09.08）