董兵　余裕強(qiáng)　李顯赫　李智鵬　宮鵬濤　李建華　張西臣

摘 要：為了建立鹿人五毛滴蟲巢式PCR檢測(cè)方法并進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)人五毛滴蟲18S rRNA基因的特異性片段設(shè)計(jì)巢式PCR特異性引物，對(duì)兩輪PCR反應(yīng)的退火溫度和反應(yīng)體系中Mg2+濃度進(jìn)行探索和優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過靈敏性和特異性的檢測(cè)。采用建立的巢式PCR檢測(cè)方法對(duì)68份鹿糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，建立的巢式PCR方法，第一輪PCR最適退火溫度為53 ℃，第二輪PCR最適退火溫度為53 ℃；鎂離子濃度為2.5 mmol·L-1。對(duì)鹿人五毛滴蟲的檢測(cè)精度可達(dá)每毫升10個(gè)蟲體DNA；對(duì)犬賈第蟲、陰道毛滴蟲、弓形蟲、柔嫩艾美爾球蟲、大腸桿菌、旋毛蟲基因組DNA的擴(kuò)增的結(jié)果均為陰性；68份鹿糞便樣品鹿人五毛滴蟲的檢出率為50%。由此可見，建立的巢式PCR檢測(cè)方法具有較高的靈敏度和特異性，可用于鹿人五毛滴蟲感染的臨床檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：鹿；腸道毛滴蟲；巢式PCR

中圖分類號(hào)：S852.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.002

毛滴蟲是一種有鞭毛的單細(xì)胞真核生物，其滋養(yǎng)體經(jīng)而分裂增殖，主要寄生在泌尿生殖系統(tǒng)以及胃腸道，宿主范圍廣泛[1]。目前，常見的毛滴蟲有人五毛滴蟲（Pentatrichomonas hominis）、陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis）、口腔毛滴蟲（Trichomonas tenax）、胚胎三毛滴蟲（Trichomonas foetus）、鳥毛滴蟲（Trichomonas gallinae）、豬三毛滴蟲（Tritrichomonas suis）、巴特里四毛滴蟲（Tetratrichomonas buttreyi）等，其中人五毛滴蟲被認(rèn)為是寄生在哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的一類共生類寄生蟲[2]，近幾年，在我國(guó)河南、湖北、廣東、安徽等地均有關(guān)于人感染人五毛滴蟲的臨床病例報(bào)道[3-8]，而在犬、貓、非靈長(zhǎng)類和嚙齒類動(dòng)物的糞便樣品中，也檢測(cè)到了人五毛滴蟲的感染 [9-11]。由于尚未有關(guān)于鹿感染人五毛滴蟲的報(bào)道，因而構(gòu)建一個(gè)快速有效的檢測(cè)方法來評(píng)估鹿感染人五毛滴蟲的感染情況顯得十分必要。

人五毛滴蟲主要通過污染飲用水或者食物而被動(dòng)物或者人誤食而感染，在傳播過程中蒼蠅等也發(fā)揮著一定作用，其感染后主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉[12]。診斷腸道毛滴蟲的主要方法包括直接涂片鏡檢法、蟲體培養(yǎng)法、染色鏡檢法、普通PCR 檢測(cè)法、巢氏PCR檢測(cè)法、原位雜交檢測(cè)法等[13]，其中直接涂片鏡檢法、蟲體培養(yǎng)法、普通PCR 檢測(cè)法和染色鏡檢法精確度不高，原位雜交檢測(cè)法實(shí)驗(yàn)條件要求高且步驟復(fù)雜，而巢式PCR檢測(cè)法常被視為一種快速、便捷、有效的檢測(cè)方法。本試驗(yàn)通過18S rRNA基因設(shè)計(jì)了特異性的巢式PCR引物，對(duì)鎂離子濃度及退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)一步進(jìn)行了特異性和靈敏性驗(yàn)證，成功構(gòu)建了鹿人五毛滴蟲巢式PCR檢測(cè)方法。采用構(gòu)建的巢式PCR檢測(cè)方法對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)68份鹿糞便樣品進(jìn)行了檢測(cè)，以期為臨床檢測(cè)鹿人五毛滴蟲的感染提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 基因組DNA

試驗(yàn)中涉及的人五毛滴蟲、柔嫩艾美爾球蟲、伊氏錐蟲、弓形蟲、陰道毛滴蟲、賈第蟲均來自于吉林大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存或者培養(yǎng)的，分別提取對(duì)應(yīng)的基因組DNA并保存在-20 ℃冰箱中。試驗(yàn)中用于臨床檢測(cè)的68份鹿糞便樣品，均來自于吉林省長(zhǎng)春市某養(yǎng)殖場(chǎng)，分別提取對(duì)應(yīng)的基因組DNA并保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑

rTaq DNA聚合酶、dNTP，MgCl2等用于PCR反應(yīng)的試劑均購(gòu)自TaKaRa公司（日本）；DL2000 DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司（日本）；瓊脂糖購(gòu)自法國(guó)Biowest公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

從Genbank中查找到人五毛滴蟲18S rRNA基因序列（AY758392），根據(jù)此特異性序列，采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)內(nèi)外兩套特意性的巢式PCR引物，外側(cè)引物： F1為5′- AGACACGGAGGCGAAGG-3′，R1為5′- AGCCCAGAGCATCTAA AGGA-3′；內(nèi)側(cè)引物：F2為5′- AGTTCTTGGGCTC TGGG-3′，R2為5′- CCTCTTCCGCCTGCTA -3′。經(jīng)兩輪PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增的目的片段為大小為322bp的特異性序列。PCR反應(yīng)中使用的引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.4 反應(yīng)體系中Mg2+濃度的優(yōu)化

以人五毛滴蟲基因組DNA作為模板，F(xiàn)1/ R1引物對(duì)作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)， MgCl2 0.5～5.5 mmol·L-1，5 μL dNTPs，0.5 μL rTaq酶，引物F1和 R1各1 μL，以雙蒸水補(bǔ)足體積至50 μL。退火溫度為53 ℃，延伸時(shí)間為35 s。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)比目的條帶的亮度。

1.5 退火溫度的優(yōu)化

分別對(duì)巢式PCR的兩輪PCR反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，第1輪PCR反應(yīng)（引物對(duì)為F1/ R1）以人五毛滴蟲基因組DNA作為模板，MgCl2的終濃度為2.5 mmol·L-1，其他試劑加入量參照上述PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性3 min，退火（50，53，55，58 ℃）1 min，72 ℃延伸35 s，循環(huán)30次； 72 ℃延伸10 min。

第2輪PCR反應(yīng)，取1 μL第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板，以內(nèi)側(cè)引物對(duì)F2/R2作為此次PCR反應(yīng)的引物，反應(yīng)體系參照第一輪PCR反應(yīng)，退火溫度設(shè)置4個(gè)梯度，分別是50，53，55，58 ℃。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.6 方法的驗(yàn)證

1.6.1 靈敏度測(cè)試 取人五毛滴蟲，計(jì)數(shù)，分別將其稀釋成1，1 × 101，1 × 102，1 × 103，1 × 104，1 × 105個(gè)·mL-1，提取對(duì)應(yīng)的基因組DNA，采用構(gòu)建好的巢式PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試其靈敏度。

1.6.2 特異性驗(yàn)證 以人五毛滴蟲基因組DNA作為陽性對(duì)照，雙蒸水作為陰性對(duì)照，采用已經(jīng)構(gòu)建好的巢式PCR反應(yīng)對(duì)柔嫩艾美爾球蟲、伊氏錐蟲、弓形蟲、陰道毛滴蟲、賈第蟲、犬心絲蟲的蟲體基因組進(jìn)行檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 樣品的檢測(cè)

以人五毛滴蟲基因組DNA作為陽性對(duì)照，雙蒸水作為陰性對(duì)照，采用已構(gòu)建好的巢式PCR方法對(duì)采集到的68份鹿糞便臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行序列的比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系中最佳Mg2+濃度

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由電泳圖可知，巢式PCR反應(yīng)在MgCl2濃度為0.5～5.5 mmol·L-1區(qū)間均能擴(kuò)增出較好的條帶，不同MgCl2濃度其對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物亮度有差異，當(dāng)Mg2+濃度為2.5 mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增出的目的片段最亮，見圖1。因此選擇2.5 mmol·L-1作為巢式PCR反應(yīng)的最佳Mg2+濃度。

bp M 1 2 3 4 5 6

2.2 最佳退火溫度

為了摸索適合于本巢式PCR反應(yīng)的退火溫度，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了50，53，55，58 ℃這4個(gè)溫度梯度，以期探索出退火溫度對(duì)巢式PCR反應(yīng)的影響。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，第一輪和第二輪PCR反應(yīng)50，53，55，58 ℃這4個(gè)退火溫度均能擴(kuò)增出目的片段，且第一輪PCR反應(yīng)和第二輪PCR反應(yīng)均在53 ℃退火溫度條件下擴(kuò)增出較為明亮的PCR產(chǎn)物，見圖2。將測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接后，BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示其均為人五毛滴蟲18S rRNA基因的特異性片段。將PCR反應(yīng)重復(fù)操作兩次，電泳結(jié)果相一致，故可選擇53℃作為兩輪PCR反應(yīng)的退火溫度。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

2.3 方法的驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 靈敏度 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，當(dāng)蟲體濃度為10個(gè)·mL-1及以上時(shí)，可見明亮的條帶即PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了目的條帶。將PCR反應(yīng)重復(fù)操作兩次，電泳結(jié)果相一致，表明本試驗(yàn)構(gòu)建的巢式PCR檢測(cè)方法可檢測(cè)的最低蟲體量為10個(gè)·mL-1。

bp M 1 2 3 4 5 6

2.3.2 特異性 將已完成了兩輪PCR反應(yīng)的8個(gè)樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖4。由圖可知，只有模板為人五毛滴蟲基因組DNA的樣品才擴(kuò)增出目的條帶，以其他蟲體基因組DNA為模板的樣品未擴(kuò)增出目的條帶。由此表明構(gòu)建的巢式PCR檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

2.4 樣品檢測(cè)結(jié)果

分別對(duì)68份鹿糞便臨床樣品進(jìn)行基因組提取，然后采用此巢式PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，34份樣品的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)目的條帶，通過對(duì)擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)，證明其均為人五毛滴蟲18S rRNA基因的特異性片段，鹿糞樣品人五毛滴蟲的檢出率為50%。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其越來越廣泛的運(yùn)用于對(duì)毛滴蟲的分類鑒定中，Gookin等[14]采用18S rRNA基因、ITS1， 5.8S rRNA， ITS2基因以及部分28S rRNA基因作為靶基因?qū)γ蜗x進(jìn)行了分子分類鑒定，通過對(duì)基因序列的比對(duì)確定了其所觀察到的毛滴蟲為人五毛滴蟲。

核糖體RNA也就是rRNA是細(xì)胞內(nèi)含量最多的一類RNA，其與蛋白質(zhì)組合而成的核糖體參與了細(xì)胞內(nèi)肽鏈的合成。對(duì)于真核生物，rRNA根據(jù)沉降系數(shù)可將其分為四類，即5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。由于18S rRNA含量較高，長(zhǎng)度適宜，大約在1 900 bp，且其存在核糖體蛋白質(zhì)復(fù)合物中[15]，能夠?yàn)?8S rRNA提供一個(gè)隔絕RNA酶和其他外界不利因素影響的安全環(huán)境，使18S rRNA能夠保持很強(qiáng)的穩(wěn)定性[16]。因此，18S rRNA常被用來對(duì)寄生蟲進(jìn)行種屬鑒定、遺傳多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化研究、分子分類乃至于抗藥性等研究 [17-18]。

目前，對(duì)于毛滴蟲最常用的檢測(cè)方法是PCR技術(shù)。但是，普通的PCR技術(shù)的靈敏度不是很高，且容易出現(xiàn)假陽性。巢氏PCR通過使用內(nèi)外兩套引物對(duì)特異性基因進(jìn)行不同大小片段的兩次擴(kuò)增，只需要極少量的模板，即可擴(kuò)增出理想的PCR產(chǎn)物極大的提高了檢測(cè)的靈敏度，并保證了檢測(cè)結(jié)果的特異性[19]。

本試驗(yàn)通過選取人五毛滴蟲18S rRNA基因片段，建立了鹿人五毛滴蟲巢式PCR檢測(cè)方法，在對(duì)巢式PCR反應(yīng)中涉及到的退火溫度、Mg2+濃度進(jìn)行了優(yōu)化后，此檢測(cè)方法表現(xiàn)出了較高的靈敏度和特異性。通過對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果的分析，證明了檢測(cè)的巢式PCR檢測(cè)方法可以用來對(duì)鹿人五毛滴蟲的臨床檢測(cè)。同時(shí)，通過對(duì)鹿的糞便樣品的檢測(cè)，說明了人五毛滴蟲可以感染鹿且具有較高的感染率，人五毛滴蟲可能會(huì)由鹿傳播給人，存在著人獸共患的風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LI W， LI W， GONG P， et al. Molecular and morphologic identification of Pentatrichomonas hominis in swine [J]. Veterinary Parasitology， 2014， 202（3-4）： 241-247.

[2] Gookin J L， Stauffer S H， Coccaro M R， et al. Optimization of a species-specific polymerase chain reaction assay for identification of Pentatrichomonas hominis in canine fecal specimens[J]. Am J Vet Res， 2007， 68（7）： 783-787.

[3] 徐丕林，舒軍. 對(duì)人毛滴蟲感染致腹瀉誤診病例的分析[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2014，12（7）：267-268.

[4] 郭鄂平，宋明華，郭冀萍.人毛滴蟲病36例臨床分析[J].臨床醫(yī)學(xué)，2003，23（5）：18-19.

[5] Meloni D， Mantini C， Goustille J， et al. Molecular identification of Pentatrichomonas hominis in two patients with gastrointestinal symptoms[J]. J Clin Pathol， 2011， 64 （10）： 933-935.

[6] Gookin J L， Birkenheuer A J， St J V， et al. Molecular characterization of Trichomonads from feces of dogs with diarrhea[J]. J Parasitol， 2005， 91 （4）： 939-943.

[7] Gookin J L， Stauffer S H， Levy M G. Identification of Pentatrichomonas hominis in feline fecal samples by polymerase chain reaction assay[J]. Vet Parasitol， 2007， 145 （1-2）： 11-15.

[8] Kondova I， Simon MA， Klumpp SA， et al. Trichomonad gastritis in rhesus macaques （Macaca mulatta） infected with simian immunodeficiency virus[J]. Vet Pathol， 2005， 42 （1）： 19-29.

[9] 王彥平，李志滿，劉兆銘. 實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物腸道內(nèi)鞭毛蟲的觀察[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志， 2003（6）： 40-42.

[10] 鄭多魁.犬毛滴蟲病的診治一例[J].中國(guó)工作犬業(yè)， 2009（10）： 21.

[11] 孟瑩. 犬源毛滴蟲的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2013.

[12] Sabucedo A J， Furton K G. Estimation of postmortem interval using the protein marker cardiac Troponin I [J]. Forensic science international， 2003， 134（1）： 11-6.

[13] 李文燦.大鼠心肌組織中microRNA和18S rRNA的含量變化與死亡時(shí)間的相關(guān)性研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2011.

[14] Capowski E E， Tracy J W. Ribosomal RNA processing and the role of SmMAK16 in ribosome biogenesis in Schistosoma mansoni [J]. Molecular and biochemical parasitology， 2003， 132（2）： 67-74.

[15] Pechmann S， Willmund F， Frydman J. The Ribosome as a Hub for Protein Quality Control [J]. Mol Cell， 2013， 49（3）： 411-21.

[16] Hoelzle L E， Adelt D， Hoelzle K， et al. Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection of Mycoplasma suis （Eperythrozoon suis） in porcine blood [J]. Veterinary microbiology， 2003， 93（3）： 185-96.

[17] Capowski E E， Tracy J W. Ribosomal RNA processing and the role of SmMAK16 in ribosome biogenesis in Schistosoma mansoni [J]. Molecular and biochemical parasitology， 2003， 132（2）： 67-74.

[18] Pechmann S， Willmund F， Frydman J. The Ribosome as a Hub for Protein Quality Control [J]. Mol Cell， 2013， 49（3）： 411-421.

[19] Hoelzle L E，Adeh D，Hoelzle K，et a1.Development of a diag' nostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection of Mycoplasma Suis（Eperythrozoon suis）in porcine blood[J]. Vet Microbiol，2003，93（3）：185-196.