張化冰，許嶺翎，聶 敏

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點實驗室，北京100730

一例原發(fā)性腎性糖尿患者的臨床與基因突變分析

張化冰，許嶺翎，聶 敏

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點實驗室，北京100730

目的 探討1例原發(fā)性腎性糖尿 (primary renal glucosuria，PRG)患者的臨床表現(xiàn)及其分子生物學基礎(chǔ)。方法詳細收集患者的臨床資料、生化檢查及影像學檢查結(jié)果，抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction，PCR)擴增SLC5A2基因的14個外顯子及其與內(nèi)含子的交界區(qū)，測序確定突變情況。結(jié)果 患者臨床表現(xiàn)、實驗室檢查和影像學檢查符合PRG診斷?；蛲蛔兎治鲲@示，患者SLC5A2基因cDNA序列的第877位腺嘌呤A突變?yōu)樾叵汆奏(c.877 A＞G)，造成第293位氨基酸由絲氨酸改變?yōu)榘腚装彼?(p.Ser293Cys)，該突變位于SLC5A2的第7外顯子。蛋白序列的保守性分析和突變蛋白的功能分析均表明p.Ser293Cys為致病性突變。結(jié)論 通過SLC5A2基因突變分析，從分子遺傳學方面證實患者PRG的診斷。臨床上血糖正常的患者出現(xiàn)尿糖陽性且無其他近端腎小管功能障礙表現(xiàn)的患者應(yīng)該考慮到該疾病可能，基因分析有助于確診。

原發(fā)性腎性糖尿;家族性腎性糖尿;SLC5A2基因;鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白2;基因突變

Med J PUMCH，2015，6(6):406－409

原發(fā)性腎性糖尿 (primary renal glucosuria，PRG，OMIM 233100)，也稱為家族性腎性糖尿 (familial renal glucosuria，F(xiàn)RG)，是一種在血糖低于正常腎糖閾 (10 mmol/L)時尿中即出現(xiàn)葡萄糖，同時近端腎小管的其他功能正常的疾病。目前已經(jīng)明確它主要是由位于16號染色體短臂1區(qū)1帶2亞帶 (16p11.2)的SLC5A2基因突變導(dǎo)致［1］。SLC5A2基因共長7.7 kb，由14個外顯子組成，編碼SGLT2鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運子。SGLT2蛋白由673個氨基酸組成，是一個低親和力高容量的鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運子，位于近端腎小管的S1段，含14個跨膜結(jié)構(gòu)。SGLT2蛋白的突變可以導(dǎo)致腎臟葡萄糖重吸收障礙，從而導(dǎo)致在血糖正常時尿中出現(xiàn)葡萄糖。PRG現(xiàn)在被認為是一種常染色體共顯性遺傳同時不完全外顯的疾?。?］。本研究分析1例PRG患者的臨床、實驗室檢查和SLC5A2基因突變情況，旨在探討PRG患者的臨床表現(xiàn)及其分子生物學基礎(chǔ)，以提高對本病的認識。

對象和方法

對象

北京協(xié)和醫(yī)院收治的1例腎性糖尿患者，經(jīng)體格檢查和實驗室檢查后，確診為PRG。經(jīng)患者知情同意，北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會同意，抽取外周血，提取基因組DNA進行SLC5A2基因分析。

基因分析方法

基因組DNA提取:采用QIAampDNA Blood Mini Kit試劑盒 (Qiagen，德國)提取，參照試劑盒說明提取外周血白細胞基因組DNA。

聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction，PCR)擴增SLC5A2基因片段:根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中的SLC5A2基因序列 (NG_012892)設(shè)計引物，擴增SLC5A2基因的14個外顯子及其與內(nèi)含子交界區(qū)，引物由天一輝遠生物技術(shù)公司合成，PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min;94℃變性60 s，59～63℃退火30 s，72℃延伸20～60 s(表1)，循環(huán)35次;循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物片段大小。

PCR產(chǎn)物直接測序:采用DNA純化回收試劑盒［天根生化科技 (北京)有限公司］純化回收PCR產(chǎn)物，送諾賽基因公司用 ABI 3700熒光自動測序儀(ABI，美國)測序。

測序結(jié)果分析:測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫進行比對分析 (SLC5A2 cDNA: NM003041.3，SGLT2蛋白:NP_003032)，以確定變異的位點和類型。并進一步與NCBI SNP和Ensemble數(shù)據(jù)庫及人類基因突變數(shù)據(jù)庫 (Human Gene Mutation Database，HGMD)進行比對，排除變異位點為基因多態(tài)性位點并確定其是否為未報道過的新突變位點。

對突變蛋白的功能預(yù)測:首先分析突變位點在不同物種中的保守性，其次使用非同義突變功能預(yù)測軟件 SIFT(http://sift.jcvi.org/)［3］、Polyphen-2(http:// genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)［4］和 Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/)［5］對含錯義突變的SGLT2蛋白進行致病性預(yù)測。

表1 SLC5A2基因擴增引物

結(jié)果

臨床資料

患者男性，22歲。因“發(fā)現(xiàn)尿糖陽性2年”于2011年2月18日來北京協(xié)和醫(yī)院就診?；颊?008年體檢時發(fā)現(xiàn)尿糖“陽性”，同時查空腹及餐后2 h血糖均正常 (具體不詳，化驗單已丟失)。2011年2月10日患者在外院查空腹血糖4.8 mmol/L，尿糖 (+++)，尿蛋白 (－)，尿紅細胞及白細胞均 (－)。平素患者無明顯多飲多尿，夜尿0次，尿中泡沫不多，食欲好，體力好，無體位性低血壓，體重無明顯變化，大便正常。為進一步明確原因就診。無泌尿生殖系統(tǒng)感染病史，無毒物接觸史，無腎毒性藥物使用史。家族史:父母非近親結(jié)婚，父母均無尿糖資料，父親有糖尿病。體格檢查:血壓120/70 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，身高168 cm，體重55 kg，一般情況好，雙肺呼吸音清，心率80次/min，齊，雙下肢不腫。

實驗室和影像學檢查結(jié)果

血液檢測:肌酐84 μmol/L，鈉142 mmol/L，鉀4.1 mmol/L，鈣2.28 mmol/L，磷0.95 mmol/L，空腹血糖4.8 mmol/L，餐后2 h血糖6.5 mmol/L，尿酸224 μmol/L，總膽固醇 4.3 mmol/L，甘油三酯0.74 mmol/L，低密度脂蛋白膽固醇2.76 mmol/L，高密度脂蛋白膽固醇1.34 mmol/L;肝功正常;HbA1c 4.9%;血β2微球蛋白1.7 mg/L，血免疫電泳 (－);動脈血氣pH 7.41，HCO3－25.6 mmol/L。

尿液檢測:尿常規(guī) (空腹及餐后2 h)均為葡萄糖≥55 mmol/L，余 (－)，尿沉渣 (－);24 h尿糖9.6 g。尿氨基酸 (－)，尿白蛋白肌酐比0.92 mg/mmol，尿β2微球蛋白0.581 mg/L，尿免疫電泳 (－)。

影像學檢查:腎臟B超示雙腎未見明顯異常。

SLC5A2基因突變分析結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物檢測:以患者DNA為模板，分別用引物進行PCR擴增，產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳EB染色后，均見一清晰條帶，且與預(yù)期片段大小相符。

基因突變分析:測序結(jié)果顯示，患者的SLC5A2基因第7外顯子發(fā)生錯義突變，為c.877 A＞G雜合突變，造成第293位氨基酸由絲氨酸改變?yōu)榘腚装彼?，即p.Ser293Cys(圖1)。與NCBI SNP和Ensemble數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果表明，SLC5A2 c.877 A＞G不是多態(tài)性位點，在HMGD數(shù)據(jù)庫 (http://www.hgmd.cf.ac.uk/)檢索發(fā)現(xiàn)，c.877 A＞G突變?yōu)槲磮蟮肋^的新突變。

突變蛋白的功能預(yù)測:SGLT2蛋白第293位的絲氨酸在人、大鼠、小鼠、兔、牛、大猩猩、馬、荷蘭豬、恒河猴、狗中高度保守 (圖2)。同時，SIFT、Polyphen-2和Mutation Taster軟件對錯義突變的功能影響預(yù)測結(jié)果顯示:該突變很可能影響SGLT2蛋白的功能，是致病性突變。SIFT和Polyphen-2的評分分別為0.02和0.999(敏感性:0.14;特異性:0.99)。

討論

本例患者22歲，男性，因“發(fā)現(xiàn)尿糖陽性2年”就診?；颊咴谘峭耆r反復(fù)檢測尿糖陽性，同時腎功能正常，沒有其他近端腎小管功能異常的證據(jù)，包括沒有氨基酸、小分子量蛋白質(zhì)、碳酸氫根、磷從尿中丟失，可以診斷PRG。

圖1 SLC5A2基因第7外顯子正鏈部分片段的測序結(jié)果圖

圖2 不同種屬的SGLT2蛋白多序列比對圖

正常成人每日從腎小球濾出約180 g葡萄糖，但是終尿中尿糖多小于0.5 g/d，主要是由于近端腎小管的重吸收作用，其占腎臟葡萄糖重吸收的90%以上，因此在血糖正常的情況下尿糖應(yīng)為陰性。當血糖正常時尿糖陽性，主要是由于近端腎小管重吸收葡萄糖功能異常所致，有兩種原因，一種是繼發(fā)性腎性糖尿，是作為范可尼綜合征的一部分，為近端腎小管功能普遍異常，除尿糖陽性外可合并氨基酸、蛋白質(zhì)、磷、HCO3－重吸收的障礙;除外繼發(fā)性腎性糖尿后可以診斷為原發(fā)性腎性糖尿。

目前研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)PRG是由于SLC5A2基因突變導(dǎo)致的SGLT2蛋白突變造成［6］。其他目前發(fā)現(xiàn)的可以影響腎臟葡萄糖重吸收的蛋白還包括SGLT1蛋白，但SGLT1蛋白在腸道和腎臟均有表達，主要表現(xiàn)為腸道對葡萄糖和乳糖的吸收下降，而SGLT1對腎臟葡萄糖重吸收的作用較弱，患者沒有腸道表現(xiàn)，不支持SGLT1蛋白突變［7］。目前還發(fā)現(xiàn)有一些可能的基因如GLYS1基因可引起腎性糖尿［8］，所以基因診斷有助于PRG病因的確診。

本例患者行基因檢測明確為SLC5A2基因c.877 A＞G雜合突變，造成SGLT2蛋白第293位氨基酸由絲氨酸改變?yōu)榘腚装彼?，通過對不同種屬該位點的蛋白序列的保守性分析及多種點突變功能預(yù)測軟件分析，均支持該突變?yōu)橹虏⊥蛔儭?/p>

目前文獻中已報道SLC5A2基因突變超過70種，沒有明顯的突變熱點［2，8-10］。本例患者的突變亦為新突變，與之前經(jīng)驗符合。目前認為本病的遺傳方式為共顯性遺傳，并且外顯不完全，雜合突變即可發(fā)病，但是亦有可能不發(fā)病，可能取決于功能正常的基因?qū)ζ咸烟侵匚盏拇鷥斈芰Γ?1］?；蛐团c表現(xiàn)型的關(guān)系主要表現(xiàn)為純合突變和復(fù)合雜合突變比單純雜合突變病情更重，尿糖丟失更多，純合突變和復(fù)合雜合突變尿糖丟失多＞10 g/d，而單純雜合突變多＜10 g/d［1］，本患者為單純雜合突變，每日尿糖丟失為9.6 g，與這一規(guī)律符合。

PRG患者的臨床表現(xiàn)多為良性過程，多數(shù)為體檢發(fā)現(xiàn)，臨床癥狀輕微，與本例患者臨床特點相符。尿糖丟失較多的患者可以出現(xiàn)多飲多尿，嚴重時可出現(xiàn)脫水、低血壓的臨床表現(xiàn)，但總體來說患者長期隨訪基本沒有嚴重并發(fā)癥出現(xiàn)［7］?，F(xiàn)在已經(jīng)有SGLT2抑制劑用于臨床治療糖尿?。?］，對PRG患者的長期隨訪有助于了解SGLT2抑制劑的長期不良反應(yīng)。

總之，PRG是由SLC5A2基因突變導(dǎo)致的一種少見遺傳性疾病，臨床上血糖正常的患者出現(xiàn)尿糖陽性且沒有其他近端腎小管功能障礙的表現(xiàn)應(yīng)考慮該疾病診斷，基因分析有助于確診。

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Clinical and Genetic Analysis of a Patient with Primary Renal Glucosuria

ZHANG Hua-bing，XU Ling-ling，NIE Min

Department of Endocrinology，Key Laboratory of Endocrinology of Ministry of Health，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

ObjectiveTo analyze the clinical manifestations and molecular basis of a patient with primary renal glucosuria(PRG)．MethodsClinical features，laboratory data，and imaging results were collected．Genomic DNA was extracted from leukocytes of peripheral blood of the patient．Fourteen exons of the PRG gene and their boundaries with introns were amplified by polymerase chain reaction(PCR)．The mutations of the SLC5A2 gene were identified by direct sequencing．ResultsPRG was diagnosed on the basis of comprehensive consideration of clinical presentations，laboratory test results，and imaging findings．Gene mutation test revealed a nucleotide substitution of guanine for adenine at the position 877 of cDNA sequence of SLC5A2 gene (c.877 A＞G)，which caused a missense mutation of serine to cysteine at codon 293(p.Ser293Cys)．It occurred at the 7th exon of SLC5A2．Loci conservation analysis and functional prediction of missense mutation of SLC5A2 protein revealed that p.Ser293Cys was a pathogenic mutation．ConclusionsSLC5A2 gene mutation analysis confirms the diagnosis of PRG in this patient from the aspect of molecular genetics．It is important to suspect PRG in patients with renal glucosuria and normal blood glucose in the absence of other manifestations ofproximal renal tubular dysfunction．Genetic analysis of SLC5A2 may be helpful to confirm the diagnosis．

primary renal glucosuria;familial renal glucosuria;SLC5A2 gene;SGLT2 protein;gene mutation

NIE Min Tel:010-69155100，E-mail:nm_pumch@aliyun．com

R589.1;R596.2;R692.6

A

1674-9081(2015)06-0406-04

10.3969/j.issn.1674-9081.2015.06.002

2015-07-23)

聶 敏 電話:010-69155100，E-mail:nm_pumch@aliyun．com

國家自然科學基金(81270879);國家臨床重點專科建設(shè)項目 (WBYZ2011-873);北京協(xié)和醫(yī)院中青年科研基金 (pumch-2013-060)