何 靚 楊江帆 屠幼英*

(1.浙江大學茶學系，浙江 杭州 310058； 2.武夷學院，福建 武夷山 354300)

不同年份武夷水仙對肺癌細胞的影響

何 靚1楊江帆2屠幼英1*

(1.浙江大學茶學系，浙江 杭州 310058； 2.武夷學院，福建 武夷山 354300)

本文研究了不同年份武夷水仙(2006、2007、2008和2009年)的主要生化成分，并通過MTT比色法測定比較了不同年份武夷水仙茶湯提取液的抗人類肺癌SPC-A1細胞的能力。結果表明：武夷水仙的抗癌能力不隨存放時間增加而持續(xù)增強，其中2008年武夷水仙抑制肺癌細胞生長能力最強，茶褐素和茶色素總量與其抗癌能力有明顯的相關作用。

烏龍茶；茶色素；肺癌細胞

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高、增長最快的癌癥之一。肺癌的病因雖然至今尚不明確，但是大量研究表明：長期吸煙與肺癌發(fā)病率有密切的關系，15%的主動吸煙者容易患上肺癌[1-2]。大量流行病學調查研究表明：茶能夠預防和抑制腫瘤的發(fā)生，喝茶能使患肺癌的機率顯著降低22%(RR：0.78，95% CI：0.70-0.87)[3]。茶葉對肺癌的抑制作用大多與保護正常細胞、修復受損細胞、抑制肺癌細胞和阻礙癌細胞的信息傳遞等作用有關[4]。其中，茶多酚及其氧化產物對癌細胞凋亡的誘導和促進作用密切相關[5-10]。

中國六大茶類之一的烏龍茶，又稱青茶，主要產于我國福建、臺灣和廣東地區(qū)。研究表明，烏龍茶具有抗突變及抑制癌癥的功效。葉飛[12]發(fā)現在50～100 μg·mL-1濃度時，烏龍茶對香煙煙霧水溶液(CSS)引起的人支氣管上皮細胞(HBE)細胞損傷作用有較好的保護作用；許鋼[13]研究認為，大量的亞硝胺類物質可影響基因表達而導致腫瘤的發(fā)生，而烏龍茶對亞硝胺合成有阻斷作用以及對亞硝酸鹽有清除作用；阮景綽[14]研究發(fā)現烏龍茶不僅能降低MNNG(N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍)誘發(fā)大鼠胃腸道惡性腫瘤的發(fā)生率，還能抑制腫瘤的生長和轉移；周海虹等[15]研究得出烏龍茶水提物在體外對一些瘤細胞株有直接抑制作用，并在荷瘤動物活體上顯示出明顯的抗腫瘤作用。Naoko Niho[16]等從烏龍茶中提取的黃酮物質能夠有效預防結腸癌。Hiroshige Hibasami[17]等研究表明烏龍茶中的多酚提取物能促進人結腸癌COLO 205細胞凋亡。但是，不同存放時間的烏龍茶及其提取物對肺癌細胞的作用未見詳細研究報道。因此，本文擬研究不同年份武夷水仙對人類肺癌SPC-A1細胞的生長抑制作用，以期探究不同存放時間對烏龍茶抗癌能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 2006、2007、2008、2009年份的武夷水仙(武夷星公司，且為老嫩度相當的同一品種)；人肺癌細胞株A549(中科院上海細胞庫)；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青公司)。

1.1.2 試劑 乙腈、甲醇；碳酸氫鈉；考馬斯亮藍G250；Sephadex LH- 20；正丁醇、冰乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、蒽酮等；水為實驗室一級用水，電導率(25℃)為0.01 mS/m。

1.1.3 儀器 AL104 電子天平；DK-88電熱恒溫水浴鍋；UV759S 紫外可見分光光度計；DGX-9073B-Z電熱恒溫鼓風干燥箱；LC2010高效液相色譜；P270半制備色譜，UV230+紫外可見檢測器，EC2000色譜數據處理工作站等。

1.2 方法

1.2.1 茶湯浸提 茶湯浸提:稱取1 g(準確至0.001 g)磨碎試樣于150 mL錐形瓶中加沸蒸餾水80 mL，立即移入沸水浴中浸提30 min(每隔10 min搖動一次)。浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，冷卻后定容于100 mL容量瓶中。

1.2.2 基本生化成分測定 茶葉含水量的測定：采用103℃恒重法[18]；水浸出物含量的測定: 采用全量法[18]；多酚類含量的測定: 采用酒石酸鐵比色法[18]；氨基酸含量的測定: 采用茚三酮比色法[18]；蛋白質含量的測定：采用考馬斯亮藍法[19]；茶黃素、茶紅素、茶褐素的含量的測定：采用系統分析法[18]。

1.2.3 高效液相色譜( HPLC)法測定兒茶素組分 采用高效液相色譜( HPLC)法[20]。島津LC-2010A液相色譜柱，色譜柱(Wondasil C18-WR柱，5 μm，i.d 4.6×250mm)。紫外檢測波長280nm，柱溫恒溫15℃，進樣量10μL。流動相A：乙酸∶乙腈∶水=0.5∶3∶96.5(V∶V∶V)；流動相B：乙酸∶乙腈∶水=0.5∶30∶69.5(V∶V∶V)；洗脫梯度：0-35 min，B相從30%-85%；40-70 min, B相從85%-85%, 共80 min；流速：1.0 mL/min。

1.2.4 武夷水仙兒茶素的分離制備[21]茶葉經熱水浸提、過濾、濃縮、冷卻后用乙酸乙酯萃取，酯相真空濃縮得濃縮液，冷凍干燥后得兒茶素粗提品。加水溶解至100 mL，過濾上Sephadex LH-20柱(D 2.5 cm×75 cm)，用丙酮/水梯度洗脫。

分離所得兒茶素濃縮去丙酮后，用甲醇溶解，然后采用半制備HPLC分離純化兒茶素。液相柱(依利特10 mm×250 mm，10 μm粒徑)，紫外檢測波長280 nm，柱溫為室溫，進樣量100 mg，分別以流動相1：水∶甲醇=34∶66(V∶V)和流動相2：水∶甲醇=38∶62(V∶V)等梯度洗脫，流速為5 mL/min，收集各個峰。

1.2.5 武夷水仙茶黃素、茶紅素的提取 茶黃素的提取參見Collier[22]經典萃取方法。茶紅素的提取參見Brown[23]方法。

1.2.6 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)采用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0. 25% 胰蛋白酶和0. 02% EDTA消化、傳代細胞。用0.22 μm的的無菌微型過濾器過濾3 mL茶湯，過濾后存放于無菌試管中。將20 μL的茶湯分別加入96孔板中。24 h后，顯微鏡觀測細胞進行拍照。培養(yǎng)24 h后通過MTT比色法測定細胞存活率。

2 實驗結果

2.1 不同年份武夷水仙的生化成分

2.1.1 不同年份武夷水仙主要成分含量 對4種不同年份武夷水仙進行主要生化成分測定，包括游離氨基酸、可溶性蛋白、咖啡堿、茶多酚、茶黃素(Theaflavins，TFs)、茶紅素(Thearubigins，TR)、茶褐素(Theabrownin，TB)以及茶色素總量。

從表1中看出，不同年份武夷水仙中的氨基酸、可溶性蛋白含量無顯著性差異，但是咖啡堿、茶多酚的含量隨著存放時間的增加而遞減，2006年武夷水仙中的咖啡堿含量與2009年相比減少14.55%，茶多酚含量減少23.74%。TFs含量隨著存放時間的增加，先增加后減少，其中2007年水仙中TFs含量最高。隨著存放時間的增加，水仙中的多酚類物質發(fā)生氧化反應，從而TFs含量增加，但當增加到一定程度，隨著茶多酚的進一步氧化形成TR、TB，造成TFs含量下降。從表1中我們還可以看到，TR含量隨著存放時間的增加而增加，而TB含量先增加后減少，其中2008年武夷水仙的含量最高。茶色素由TFs、TR、TB組成， 其中， 2008年武夷水仙茶色素含量最高，相較2009年水仙增加39.09%。隨存放時間的增加，2007、2006年水仙中茶色素含量，相較2008年水仙分別降低12.49%、6.56%。

2.1.2 不同年份水仙的兒茶素含量 對不同年份武夷水仙中兒茶素及其單體的含量進行分析比較，結果如圖1所示。對于GC、EC，2006年武夷水仙含量與2009年相比，分別下降了50%、44.4%；對于EGCG、EGC和兒茶素總含量，隨著存放時間增加而含量降低，但是到2007年后趨于平穩(wěn)。2009年武夷水仙存放時間最短，其EGCG、EGC、兒茶素總量含量最高。

圖1 不同年份武夷水仙中兒茶素及其單體的含量

2.3 細胞實驗結果

如1.2.1和1.2.6所述方法，用2006年至2009年武夷水仙的茶湯提取物對人類肺癌SPC-A1細胞進行處理，24h后用MTT比色法檢測細胞抑制率，結果如圖2所示。武夷水仙對SPC-A-1細胞具有抑制增殖的作用，2007年和2006年水仙的抑制效果無顯著性差異，但都顯著高于2009年水仙。2008年水仙的肺癌細胞抑制效果最為顯著。

圖2 不同年份武夷水仙對肺癌SPC-A1細胞的抑制率

圖3 (左)為未經處理的培養(yǎng)24 h后的肺癌細胞，(右)為2009年武夷水仙作用24 h后的肺癌細胞

圖3(左)為對照組，即培養(yǎng)了24小時的未經處理的人肺癌SPC-A-1細胞，而圖3(右)是用2009年武夷水仙處理24小時后用顯微鏡觀察到的肺癌細胞。從圖中可看出，對照組的細胞生長良好，細胞間接觸緊密，而經過2009年水仙處理后的人肺癌SPC-A1細胞，細胞密度減小、變圓、皺縮。另外，經其他年份水仙處理的肺癌細胞形態(tài)變化更加明顯。圖2所示MTT 檢測結果以及圖3所示武夷水仙對SPC-A-1細胞增殖抑制的形態(tài)學變化，都證實了武夷水仙對人肺癌 SPC-A-1 細胞增殖有抑制作用。

比較不同年份武夷水仙的抗癌能力，從圖2可看出，2008年武夷水仙的細胞生長抑制作用效果最強，隨著存放時間的增加，細胞抑制率先升高后降低。首先，2008年水仙與2009年水仙相比，雖然2008年水仙中兒茶素、茶紅素、咖啡堿含量低于2009年水仙，但是其TB和茶色素總量卻都顯著高于2009年水仙，TB和茶色素總量很可能是導致二者抗癌能力差異的原因之一。2007、2006年武夷水仙細胞抑制率(76.2%、75.7%)都低于2008年(83.2%)，但是卻高于2009年水仙(62.4%)。這與表1中2007、2006年武夷水仙中的TB、茶色素總量都比2008年水仙減少，但比2009年水仙增加的結果相一致。

3 結 論

隨存放時間增加，武夷水仙的咖啡堿、茶多酚及其兒茶素的含量遞減；TR含量隨之增加；TFs含量先增加后減少，在2007年武夷水仙中達到峰值0.32%；TB和茶色素總量都先增加后減少，但在2008年武夷水仙中分別達到峰值7.91%、12.81%。

MTT 檢測結果和顯微鏡觀察顯示武夷水仙能抑制人肺癌 SPC-A-1 細胞增殖，其抗癌能力不隨存放時間增加而持續(xù)增強，2008年武夷水仙的細胞生長抑制作用比其他年份武夷水仙強。分析發(fā)現其TB含量和茶色素總量最高，因此TB、茶色素總量很可能是影響其抗癌能力的重要原因之一。盡管對茶褐素的構成尚未完全清楚，我們無法準確測定樣品中的茶褐素組成結構，但是根據所得實驗結果分析，茶褐素對SPC-A1細胞的生長是有影響的，茶褐素的組成結構值得進一步研究。

1 Cohen V. and Fadlo R, Chemoprevention of lung cancer, Current Opinion in Pulmonary Medicine, 2004, 10:279-283.

2 Dubey S. and Powell C, Update in Lung Cancer 2007, American Journal of Respiratory and Critical.Care Medicine, 2008, 177: 941-946.

3 Wang L, Zhang X, Liu J, Shen L, Li Z. Tea consumption and lung cancer risk: a meta-analysis of case-control and cohort studies.Nutrition,2014,30(10):1122-1127.

4 葉飛，劉仲華，黃建安. 吸煙與飲茶對肺癌的促發(fā)和抑制作用研究綜述. 湖南農業(yè)科學. 2009(6): 23-26.

5 Ververidis F, Trantas E, Douglas C, Vollmer G, Kretzschmar G, and Panopoulos N. Biotechnology of flavonoids and other phenylpropanoid-derived natural products. Part I: Chemical diversity, impacts on plant biology and human health, Biotechnology journal， 2007, 2:1214-1234.

6 杜春華，成煒，胡曉玲，等. 茶多酚對肺癌SPC-A1細胞增殖的影響. 山東醫(yī)藥. 2007(31): 1-3.

7 李偉，屠幼英. 茶葉提取物對抗肺癌細胞(A549)體外試驗研究. 茶葉, 2006(1): 28-30.

8 李曉煥，禹利君.吸煙與肺癌的發(fā)生及茶多酚對其防治作用研究綜述. 茶葉通訊,2013(1): 24-28.

9 TU Y. Y， Tang, A. B， and Watanabe, N. The Theaflavin Monomers Inhibit the Cancer Cells Growth in Vitro, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2004,36 (7): 508-512.

10 Yang G.Y, Liao J, Kim K, Yurkow EJ, and Yang CS. Inhibition of growth and induction of apoptosis in human cancer cell lines by tea polyphenols,Carcinogenesis,1998,19(4):611-616.

11 藍雪銘，劉志彬，倪莉. 烏龍茶保健功效的研究進展. 中國食品學報,2014(02): 201-207.

12 葉飛. 茶葉提取物對HBE細胞的保護及對A549細胞增殖的抑制作用研究.湖南農業(yè)大學，2009.

13 許鋼，黃美娟. 茶葉不同沖泡方式對亞硝化反應抑制的研究.中國食品科學技術學會第六屆年會暨第五屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集.2009:1.

14 阮景綽，汪培清等. 烏龍茶對MNNG誘發(fā)大鼠胃腸道惡性腫瘤的抑制作用.茶葉科學，1989,2:167-172.

15 周海虹，梁基選，胡維弘. 絞股藍、烏龍茶抗腫瘤實驗研究.農業(yè)考古. 2001(04):311-313.

16 Niho N, Mutoh M, Sakano K. Inhibition of intestinal carcinogenesis by a new flavone derivative, chafuroside, in oolong tea[J]. Cancer Science,2006,97(4):248-251.

17 Hibasami H, Jin Z, Yoshioka K. Human Colon Cancer Cells Undergo Apoptosis by Theaflavin Digallate, Epigallocatechin Gallate, and Oolong Tea Polyphenol Extract[J]. Journal of Herbs Spices & Medicinal Plants, 2008, spices & medicinal plants(4):29-38.

18 黃意歡.茶學實驗技術.北京:中國農業(yè)出版社, 1997.

19 黃惠華，高孔榮. 茶葉可溶性蛋白質含量的測定及添加PVP的效應研究.食品科學， 1993,11:3-6.

20 Tu Y Y, Xia H L, Watanabe N.Changes in catechins during the fermentation of green tea. Applied Biochemistry and Microbiology,2005,41(6):574-577.21 王洪新, 戴軍, 張家驪等. 茶葉兒茶素單體的分離純化及鑒定. 無錫輕工大學學報：食品與生物技術, 2001, 20(2):117-121.

22 Collier P D, Mallows R，Korver O and Thomas PE. The theaflavions of black tea.Tetrahedron， 1973,29:125-142.

23 Brown A G, Eyton WB, Holmes A and Ollis WD. Identification of the thearubigins as polymeric proanthocyanidins.Nature,1969,221:742-744.

The effect of WuYi ShuiXian Teas produced in various years on human lung cancer cells

HE Jing1， YANG Jiangfan2， TU Youying1*

(1.Tea Science Department of Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang， 310058;2.Wuyi University， Wuyishan， Fujian， 354300)

The major biochemical components of WuYi ShuiXian teas produced in various years from 2006 to 2009 and their effects on human lung cancer were investigated. The results showed that the storage time would not always enhance the anti cancer ability and that produced in 2008 had the strongest inhibition effect on the lung cancer cells. The anti-cancer ability was correlated to the levels of of theabrownin (TB) and tea pigments.

oolong tea; tea pigments; lung carcinoma cells

2015-10-22

中國烏龍茶產業(yè)協同創(chuàng)新中心(培育)2013-2016

何靚(1990年-)，女，湖北人，碩士研究生，主要從事茶葉生物化學及其綜合利用研究。

TS272.5+<9;R734.2 文獻標識碼：A class="emphasis_bold">9;R734.2 文獻標識碼：A 文章編號：0577-8921(2015)04-192-049;R734.2 文獻標識碼：A

0577-8921(2015)04-192-04

A 文章編號：0577-8921(2015)04-192-04

*通訊作者：youytu@zju.edu.cn