不同再生水消毒方式對斑馬魚胚胎毒性的影響及其危害分級

余芬芳，唐天樂，白娟娟，熊張東，唐文浩,*

1．海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海口 570228 2．海南大學(xué)?？谑协h(huán)境毒理學(xué)重點實驗室，?？?570228 3. 海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)院，?？?71101

不同再生水消毒方式對斑馬魚胚胎毒性的影響及其危害分級

余芬芳1,2，唐天樂2,3，白娟娟1,2，熊張東1,2，唐文浩1,2,*

1．海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228 2．海南大學(xué)?？谑协h(huán)境毒理學(xué)重點實驗室，?？?570228 3. 海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)院，?？?71101

以斑馬魚胚胎毒性測試研究海南某污水處理廠出水經(jīng)氯胺、二氧化氯、次氯酸鈉、臭氧和紫外幾種消毒處理后對斑馬魚胚胎的毒性。利用胚胎毒性和層次分析法構(gòu)建危害分級方法及其指標(biāo)體系，評價消毒危害。研究結(jié)果表明：消毒處理前的二沉池出水未產(chǎn)生胚胎發(fā)育毒性效應(yīng)，但經(jīng)次氯酸鈉、氯胺、臭氧、二氧化氯對再生水消毒處理可使斑馬魚胚胎出現(xiàn)卵黃囊異常、心跳減緩、色素沉積減少、孵出延緩和卷尾等毒理反應(yīng)；不同消毒方式處理的再生水可致斑馬魚胚胎死亡率增加，胚胎毒性依次為：二氧化氯<紫外<紫外+次氯酸鈉=二沉池出水(不消毒)<氯胺=紫外+氯胺<臭氧<次氯酸鈉；不同消毒方式的危害分級為：二氧化氯和紫外消毒構(gòu)成輕微危害，危害等級為I級，紫外+次氯酸鈉、紫外+氯胺、氯胺消毒構(gòu)成中度危害，危害等級為II級，次氯酸鈉危害較強，其危害等級為III級；化學(xué)消毒劑與紫外線組合消毒可降低再生水消毒的危害。

再生水；消毒方式；斑馬魚胚胎；胚胎毒性；危害分級

城市再生水回用需要進(jìn)行消毒處理。再生水消毒過程中伴隨著消毒劑與再生水中的一些溶解性有機物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生各種消毒副產(chǎn)物(DBPs)，對人群健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成潛在的威脅[1-2]。以往對于消毒帶來危害研究主要通過化學(xué)分析法測定三鹵甲烷(THMs)、鹵乙酸(HAAs)等典型DBPs的濃度或生成潛能來對各種消毒方式進(jìn)行危害比較，在進(jìn)行DBPs化合物的毒性分析時，其毒性數(shù)據(jù)也是基于單個化合物的動物毒性實驗獲得的[6]。而再生水中消毒副產(chǎn)物種類繁多，目前并不能一一檢測，本研究考慮到化學(xué)檢測的不足，運用生物檢測的方法來綜合反映再生水消毒副產(chǎn)物的生物毒性效應(yīng)及其差異。斑馬魚作為模式生物已廣泛應(yīng)用于毒性測試，并且有較好的毒性預(yù)測能力，因此，開展斑馬魚胚胎毒性的城市再生水消毒方式比較具有一定的現(xiàn)實意義。

本研究以斑馬魚胚胎為實驗材料，研究海南某污水處理廠出水經(jīng)氯胺、二氧化氯、次氯酸鈉、臭氧和紫外線幾種消毒處理后對斑馬魚胚胎的毒性差異，并根據(jù)斑馬魚胚胎的毒理學(xué)反應(yīng)構(gòu)建危害分級方法，對再生水消毒的進(jìn)行危害評價，貼近生產(chǎn)實際，可為城市再生水的消毒方式選擇提供有利指導(dǎo)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗儀器與試劑

主要儀器有：BX51電動顯微鏡、DP71(日本Olympus公司)；HW-XS-5g臭氧發(fā)生器(廣州市環(huán)偉環(huán)保科技有限公司)。

主要試劑有聚合氯化鋁(化學(xué)純)，二氧化氯(分析純)，次氯酸鈉(分析純)，氯胺(分析純)。

1.2 試驗生物

實驗所用斑馬魚為AB系藍(lán)色斑馬魚，試驗前在實驗室馴養(yǎng)1個月以上。在交配產(chǎn)卵的前1天，選擇健康且性成熟的斑馬魚，按雌雄比1∶2放入水溫保持在(26.0±1) ℃的曝氣水中混合飼養(yǎng)，光照/黑暗周期比14 h∶10 h，自然交配產(chǎn)卵[7]。產(chǎn)卵結(jié)束后，利用虹吸管將魚卵中的雜質(zhì)小心吸出，并用超純水清洗，在電動顯微鏡下挑選分裂正常的受精卵進(jìn)行暴露實驗。

1.3 試驗材料

測試水樣采自海南某污水處理廠的二沉池和紫外消毒出水，水樣經(jīng)聚合氯化鋁混凝、沉淀、過濾后，用氯胺、二氧化氯、次氯酸鈉和臭氧消毒，分別得到氯胺、二氧化氯、次氯酸鈉、臭氧、紫外、紫外+氯胺和紫外+次氯酸鈉消毒的水樣。除二沉池出水和紫外消毒出水外，其余消毒組水樣中糞大腸桿菌均達(dá)到《再生水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(SL 368-2006)中非飲用水≤200個·L-1的標(biāo)準(zhǔn)。各消毒劑濃度(以有效氯計)和對應(yīng)消毒組的糞大腸桿菌數(shù)量如表1?？瞻讓φ諡镠R營養(yǎng)液，配置方法如下：氯化鈉：38.7 mmol·L-1；氯化鉀：1.0 mmol·L-1；氯化鈣：2.4 mmol·L-1；HEPES緩沖液：1.7 mmol·L-1，調(diào)節(jié)pH至7.2，經(jīng)高溫消毒后使用。水樣置于4 ℃冰箱保存，使用前取出，使其溫度上升至室溫后使用。

1.4 實驗方法

1.4.1 測試方法

毒理實驗方法參照OECD推薦方法[3]。用移液槍取1 mL配置好的消毒水樣放入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎放入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔放1枚胚胎，蓋上蓋子，避免揮發(fā)，每板的16個孔為一個平行，每個水樣做3個平行。染毒后放入25.5 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用換水式即24 h更換受試物溶液對斑馬魚胚胎進(jìn)行暴露處理，直至幼魚孵化。用帶有攝像頭的電動顯微鏡對斑馬魚胚胎進(jìn)行觀測。暴露時間及觀測指標(biāo)如表2。

表1 消毒劑濃度和糞大腸桿菌數(shù)量Table 1 Disinfectant concentration and fecal coliform

表2 暴露時間和對應(yīng)的觀測指標(biāo)、毒理學(xué)終點Table 2 The exposure time and the observed indicators and the toxicological endpoints

各指標(biāo)統(tǒng)計方法如下： 死亡率、色素沉積減少、孵出率、卵黃囊異常(卵黃囊不延伸)、卷尾的統(tǒng)計分別為出現(xiàn)對應(yīng)指標(biāo)的斑馬魚胚胎數(shù)除以總基數(shù)，最終結(jié)果取3組平均數(shù)； 心跳統(tǒng)計：將斑馬魚胚胎置于在電動顯微鏡下觀察，用計數(shù)器給每條魚計數(shù)心室搏動，持續(xù)15 s，乘以4即可獲得每分鐘的心跳，對照組心跳±5次/min為正常心跳范圍。心跳減緩率=(對照組平均心跳-實驗組平均心跳)/對照組平均心跳；

孵出延緩：孵出延緩率=(對照組孵出率-實驗組孵出率)/對照組孵出率。

1.4.2 評價方法

采用危害分級方法對各消毒方式的毒性進(jìn)行綜合評價。目前國內(nèi)外危害評價方法大多基于特定幾種污染物質(zhì)的數(shù)量和濃度，對于復(fù)合污染體系的危害評價并不適用。本研究根據(jù)斑馬魚胚胎的毒理學(xué)反應(yīng)創(chuàng)建了危害分級評價方法，該方法不需要對污染物的種類和濃度進(jìn)行檢測，對于未知濃度的污染物在復(fù)合污染環(huán)境下的危害評價同樣適用。

參考Nagel[5]對斑馬魚胚胎的毒理學(xué)指標(biāo)分類，可將實驗中觀測到的指標(biāo)分為致死指標(biāo)(I型指標(biāo))和非致死指標(biāo)(II型指標(biāo))兩類(表3)，危害指數(shù)P則為I型指標(biāo)(所有I型指標(biāo)均統(tǒng)計為死亡率)和II型指標(biāo)加權(quán)相加值，可用以下公式表示：

fI—I型指標(biāo)即死亡率的權(quán)重

DI—死亡率

n—II型指標(biāo)的個數(shù)

fIIn—各II型指標(biāo)的權(quán)重

DIIn—各II型指標(biāo)的發(fā)生率

用層次分析法構(gòu)建各消毒方式的危害評價指標(biāo)體系和確定指標(biāo)權(quán)重[10]。該指標(biāo)體系由目標(biāo)層、準(zhǔn)則層和方案層構(gòu)成，將各種消毒方式的危害指數(shù)定為目標(biāo)層，斑馬魚胚胎的致死指標(biāo)、非致死指標(biāo)設(shè)為準(zhǔn)則層，各單項指標(biāo)設(shè)為方案層。根據(jù)專家討論分析，對所列指標(biāo)兩兩比較重要程度而逐層進(jìn)行判斷評分，構(gòu)造判斷矩陣，然后利用方根法求得最大特征根對應(yīng)的特征向量，得到單項指標(biāo)對總目標(biāo)的重要性權(quán)值。各種消毒方式的危害評價指標(biāo)權(quán)重如表3。

根據(jù)危害指數(shù)的范圍將污染物的危害等級劃分如表4。

1.4.3 統(tǒng)計分析方法

采用SAS 9.1.3統(tǒng)計分析軟件，在α=0.05的置信水平對不同再生水消毒方式暴露下斑馬魚胚胎累積死亡率的變化情況進(jìn)行ANOVO完全隨機試驗(均衡)分析。

表3 危害評價指標(biāo)體系的建立及權(quán)重的確定Table 3 The establishment and weight of hazard assessment indicator system

表4 危害等級劃分Table 4 Hazard classification

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同消毒方式對斑馬魚胚胎的致死毒性

不同消毒方式的再生水暴露對斑馬魚胚胎死亡率影響的統(tǒng)計結(jié)果(表5)。由表可見，紫外線消毒和二氧化氯消毒降低了二沉池出水的毒性，而次氯酸鈉、臭氧和氯胺消毒均增大了二沉池出水的毒性，使斑馬魚胚胎的死亡率增加。次氯酸鈉的毒性高于其他消毒劑，但次氯酸鈉+紫外組合消毒使斑馬魚胚胎死亡率降低，次氯酸鈉與紫外復(fù)合使用后生物毒性顯著降低，表現(xiàn)出拮抗作用。氯胺與紫外復(fù)合使用后胚胎累積死亡率相同。不同消毒方式處理的再生水暴露引起斑馬魚胚胎最終死亡率增加的趨勢是：二氧化氯<紫外<紫外+次氯酸鈉=二沉池出水(不消毒)<氯胺=紫外+氯胺<臭氧<次氯酸鈉。

表5 不同再生水消毒方式暴露對斑馬魚胚胎死亡率的比較Table 5 The zebrafish embryo mortality in different water sample by different disinfection method

注：若兩組數(shù)據(jù)含有相同字母，則表示差異不顯著，否則差異顯著。

Note:If the two sets of data contain the same alphabet, then the difference was not significant, otherwise the difference was significant.

2.2 不同再生水消毒方式對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性

各種消毒方式對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性統(tǒng)計如圖1。由圖可見，消毒水樣暴露對斑馬魚胚胎的發(fā)育產(chǎn)生明顯影響，主要表現(xiàn)為心跳減緩、色素沉積減少、卵黃囊異常、孵出延緩、卷尾等多種發(fā)育異常(圖2)。對照組正常斑馬魚胚胎48h平均心跳為120次/min，次氯酸鈉和氯胺消毒組斑馬魚胚胎心率低于正常范圍，其余消毒組心跳均在正常范圍內(nèi)；每一種消毒方式均使斑馬魚胚胎出現(xiàn)了卵黃囊異常、色素沉積減少、卷尾等毒性，其中，紫外消毒和二氧化氯消毒的毒性較其他消毒方式小；紫外線消毒和各種化學(xué)消毒劑單獨消毒均使斑馬魚胚胎發(fā)育延緩，主要表現(xiàn)為72 h孵出率減小，但紫外線與化學(xué)消毒劑組合使用后，對斑馬魚胚胎的發(fā)育阻滯作用消失。

2.3 不同再生水消毒方式的危害分級

表6是不同消毒方式對斑馬魚胚胎的危害分級結(jié)果。由表可知，二沉池出水、紫外消毒、二氧化氯消毒水樣的危害等級屬于I級，危害輕微；其次是臭氧和氯胺，危害等級屬于II級，構(gòu)成中度危害；次氯酸鈉的危害指數(shù)最大，危害等級為III級，危害較強。不同再生水消毒方式對斑馬魚胚胎的毒性影響及危害順序依次是：次氯酸鈉>氯胺>紫外+氯胺>紫外+次氯酸鈉>紫外>二氧化氯。

圖1 不同消毒方式引起的胚胎發(fā)育毒性Fig. 1 Developmental toxicities caused by different disinfection approaches

圖2 顯微鏡下觀察到的斑馬魚胚胎發(fā)育異?，F(xiàn)象注：A,色素沉積減少；B,卵黃囊異常；C,卷尾；D,正常魚仔。Fig. 2 Abnormal development of embryos in different water sample exposure groupsNote: A, pigmentation reduction; B, yolk sac abnormalities; C, capuchin; D, normal fish.

表6 不同消毒方式的危害分級Table 6 Hazard classification of different disinfection methods

3 討論(Discussion)

本實驗結(jié)果表明，每一種消毒方式對斑馬魚胚胎發(fā)育都有一定的毒性，毒性主要表現(xiàn)為斑馬魚胚胎的死亡率增加，心跳減緩，色素沉積減少，卵黃囊異常，孵出延緩，卷尾等。對各種消毒方式進(jìn)行危害評價，比較得出，次氯酸鈉消毒危害最大，其次是氯胺、臭氧，二氧化氯和紫外線消毒危害最小。造成這種差異的原因可能是不同消毒劑在消毒過程中產(chǎn)生的DBPs毒性不同造成的。次氯酸鈉在消毒過程中產(chǎn)生的DBPs是主要是三鹵甲烷(THMs)和鹵乙酸(HAAs)，THMs已被確認(rèn)為致癌物，同時大量的體內(nèi)和體外實驗研究表明THMs具有明顯的致突變作用或遺傳毒性，HAAs具有致癌性和致突變性，對DBPs總致癌風(fēng)險貢獻(xiàn)率達(dá)到90%以上[6]，所以次氯酸鈉在消毒過程中產(chǎn)生的危害大；氯胺消毒可以大大降低THMs和HAAs等DBPs的生成量，但有研究發(fā)現(xiàn)，氯胺消毒可能產(chǎn)生具有更大潛在危害的含氮消毒副產(chǎn)物(N-DBPs)，再生水中水質(zhì)極為復(fù)雜，N-DBPs的生成潛能會增大，所以氯胺可能并不適用于再生水的消毒；當(dāng)污水中有機物濃度較高時，臭氧在消毒過程中會生成一些含氧化合物，如醛、羧酸、酮、酚等DBPs，當(dāng)有溴離子存在時，還會生成溴酸鹽，溴酸根離子(BrO3-)具有遺傳毒性和致癌性，被世界衛(wèi)生組織列為2B類可疑致癌物[4]，因此臭氧消毒也存在一定的危害；二氧化氯是一種氧化劑而不是氯化劑，它與污染物不發(fā)生取代反應(yīng)，所以在消毒過程中幾乎不產(chǎn)生THMs等有機DBPs，消毒危害??；紫外線消毒是一種物理消毒方式，不產(chǎn)生有毒有害副產(chǎn)物，消毒危害小。

紫外線與次氯酸鈉組合消毒可降低再生水消毒的危害。這可能是由于紫外-次氯酸鈉組合消毒減少了再生水消毒的加氯量，同時減少消毒副產(chǎn)物生成量，降低了環(huán)境危害。楊川等[8]研究表明，與單一氯消毒相比，紫外-氯組合消毒可有效減少再生水中三氯甲烷的生成量，在大腸桿菌完全滅活條件下，單一氯消毒的三氯甲烷生成量是紫外-氯組合消毒生成量的12倍左右。紫外-次氯酸鈉既可以彌補氯消毒無法殺滅隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲等原聲動物的劣勢，又可以彌補紫外線無持續(xù)消毒效果的缺陷。紫外線與氯胺組合消毒與單一氯胺消毒的危害稍有降低，但效果并不顯著。而蘭旭[9]研究表明，紫外-氯胺聯(lián)合消毒過程中產(chǎn)生一種協(xié)同作用，殺菌效果好，在保證出水余氯達(dá)標(biāo)的情況下也可降低氯消毒的劑量，最大限度地降低消毒副產(chǎn)物的生成。造成這種差別的原因可能是再生水水質(zhì)較為復(fù)雜，消毒劑的消毒機理與飲用水等清潔水源的消毒有所不同，飲用水中的消毒機理研究不能直接指導(dǎo)再生水消毒，關(guān)于紫外-氯胺在再生水中消毒機理有待進(jìn)一步深入研究。

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◆

Toxicities and Hazard Classification of Reclaimed Water after Disinfection of Different Approaches by Zebrafish Embryos Bioassay

Yu Fenfang1,2, Tang Tianle2,3, Bai Juanjuan1,2, Xiong Zhangdong1,2, Tang Wenhao1,2,*

1. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China 2. Haikou Key Laboratory of Environment Toxicology, Hainan University, Haikou 570228, China 3. School of Tropical Medicine and Medical Laboratory, Hainan Medical University, Haikou 571101, China

12 October 2014 accepted 24 November 2014

The purpose of this paper is to investigate the embryos toxicity and hazard induced by the effluent from the sewage treatment plants of Hainan Province which disinfected by different approaches including chloramines, chlorine dioxide, sodium hypochlorite, ozone, and ultraviolet (UV). Zebrafish was chosen as the model animal and was exposed to the disinfected water sample in the embryonic toxicity test. To evaluate the hazard, a hazard classification method was established based on the embryos toxicity and the AHP (Analytic Hierarchy Process) model. The results indicated that: the effluent without disinfection didn’t exhibit developmental toxic effects on embryos, but all the disinfected water samples exhibited toxic effects on embryos including yolk sac abnormalities, heart rate decrease, pigmentation reduction, delay hatching and capuchin. Exposure in disinfected water samples increased the mortality rate of zebrafish embryos. The embryo toxicity showed as follows: chlorine dioxide

reclaimed water; disinfection approaches; zebrafish embryos; embryotoxicity; hazard classification

中西部高校項目(ZXBJH-XK004；XBJH-XK005；MWECSP-RT08)

余芬芳(1989-)，女，碩士，主要研究方向為生態(tài)毒理學(xué)，E-mail: yff1989@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: twh1229@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141012001

2014-10-12 錄用日期：2014-11-24

1673-5897(2015)2-313-07

X171.5

A

唐文浩(1956—)，男，學(xué)士，教授，主要從事環(huán)境科學(xué)與生態(tài)學(xué)研究。

余芬芳, 唐天樂, 白娟娟, 等. 不同再生水消毒方式對斑馬魚胚胎毒性的影響及其危害分級[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(2): 313-319

Yu F F, Tang T L, Bai J J, et al. Toxicities and hazard classification of reclaimed water after disinfection of different approaches by zebrafish embryos bioassay [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 313-319 (in Chinese)