全氟辛烷磺酸(PFOS)對(duì)半滑舌鰨肝臟細(xì)胞的毒性效應(yīng)

黨紅蕾，那廣水，高會(huì)，李瑞婧，高艷飛，姚子偉，祖國(guó)仁,#

1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034 2.國(guó)家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，大連 116023

全氟辛烷磺酸(PFOS)對(duì)半滑舌鰨肝臟細(xì)胞的毒性效應(yīng)

黨紅蕾1,2，那廣水2,*，高會(huì)2，李瑞婧2，高艷飛1，姚子偉2，祖國(guó)仁1,#

1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034 2.國(guó)家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，大連 116023

為探究海洋環(huán)境中持久性有機(jī)污染物——全氟辛烷磺酸(PFOS)的生物毒性效應(yīng)，以半滑舌鰨肝臟細(xì)胞(HTLC)為研究對(duì)象，將其暴露于含不同濃度PFOS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，分別染毒24、48、72 h后，利用噻唑藍(lán)比色法(MTT)和透射電鏡實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)PFOS的細(xì)胞毒性； 同時(shí)測(cè)定活性氧自由基(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)活性來探討PFOS對(duì)細(xì)胞的氧化損傷效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活性隨PFOS濃度升高呈先促進(jìn)后抑制趨勢(shì)，當(dāng)PFOS濃度達(dá)到1 000mol·L-1時(shí)細(xì)胞活性受到顯著抑制(P<0.01)；電鏡結(jié)果顯示PFOS能引起與代謝相關(guān)的細(xì)胞器如線粒體、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等發(fā)生腫脹甚至破損； 與對(duì)照組相比，ROS含量和SOD活性分別在20mol·L-1、200mol·L-1開始出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，證實(shí)在PFOS引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)中SOD起到了清除自由基作用以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。研究表明，PFOS對(duì)海洋魚類細(xì)胞具有一定的生物毒性，能引起細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步破壞生物膜系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和多種代謝途徑受到抑制。

全氟辛烷磺酸； 肝細(xì)胞； 半滑舌鰨； 細(xì)胞毒性； 氧化應(yīng)激

全氟辛烷磺酸(PFOS)是一種具有疏水、疏油特性的表面活性劑，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用，包括金屬電鍍、潤(rùn)滑劑、農(nóng)藥、紡織、造紙、食品包裝等[1-2]。由于具有持久性、生物蓄積性和毒性，PFOS及其鹽類在2009年被《斯德哥爾摩公約》確定為新興持久性有機(jī)污染物。由于沒有很好的替代產(chǎn)品，PFOS仍在金屬電鍍、半導(dǎo)體、航空液壓油、泡沫滅火器等領(lǐng)域生產(chǎn)和使用[3]。PFOS上的C-F鍵穩(wěn)定性強(qiáng)、難被降解，在全球范圍內(nèi)的多種環(huán)境介質(zhì)中均檢測(cè)到不同程度的PFOS污染[4-5]，并且PFOS在生物體和人體中也有大量富集[6]，因此近幾年P(guān)FOS的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)問題開始受到人們普遍關(guān)注。

相比于其他持久性有機(jī)污染物，PFOS溶解度較高、不易揮發(fā)，所以水環(huán)境是其污染傳播的重要途徑[7-8]。從世界多地海水和海洋生物的檢測(cè)結(jié)果來看，表層海水和近海岸地區(qū)的可食用海產(chǎn)品中PFOS均有檢出[9-12]，并且廢水和半導(dǎo)體制造廠附近海水中PFOS污染較嚴(yán)重[13]，在東京灣、佛蘭德斯地區(qū)以及滅火泡沫意外溢漏區(qū)域的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚體肝臟是PFOS的重要富集場(chǎng)所，其最大檢出范圍為1.8～9.03 μg·g-1[14-16]。關(guān)于PFOS對(duì)水生生物特別是魚類的毒性研究表明，PFOS屬于中等毒性并能損傷全身器官的有毒污染物，將胚胎期海洋青鱂暴露于PFOS導(dǎo)致魚幼體免疫抑制并引發(fā)炎癥反應(yīng)[17]；水中PFOS暴露引起斑馬魚胚胎致畸、影響金魚游泳性能等毒性效應(yīng)[18-20]；Jennifer等[21]發(fā)現(xiàn)低濃度PFOS染毒下大頭魚腮內(nèi)多種蛋白質(zhì)差異性表達(dá)，并且這些蛋白可能與能量代謝和細(xì)胞骨架系統(tǒng)相關(guān)。迄今為止，PFOS對(duì)海洋生物毒性效應(yīng)機(jī)制還不明確。

PFOS對(duì)海洋生物毒理效應(yīng)的研究方法大多以魚類胚胎或魚體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，由于生物體的免疫調(diào)節(jié)作用，沒有很好反映PFOS毒性作用機(jī)制。本文根據(jù)體外細(xì)胞穩(wěn)定和對(duì)污染物敏感性高的特點(diǎn)，并基于魚類肝臟作為PFOS在魚體內(nèi)的主要富集場(chǎng)所、同時(shí)也是生物體主要解毒器官的事實(shí)，以典型近海魚類半滑舌鰨肝臟細(xì)胞(HTLC)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究PFOS對(duì)細(xì)胞活性及細(xì)胞器損傷影響，揭示在氧化應(yīng)激反應(yīng)下PFOS的致毒過程，為PFOS對(duì)海洋環(huán)境和海洋生物的潛在風(fēng)險(xiǎn)研究提供海洋生物細(xì)胞毒理的依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器與試劑

儀器： 細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioRad公司)，374型熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，XD-202型倒置顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)。

試劑： 青鏈霉素抗體、四甲基偶氮噻唑藍(lán)MTT(北京索萊寶科技有限公司)，全氟辛烷磺酸鉀鹽PFOSK(純度98%，上海晶純生化科技有限公司)，DMEM-F12培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo公司)，成纖維生長(zhǎng)因子bFGF(美國(guó)PeproTech公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，ROS試劑盒、SOD試劑盒、BCA法蛋白定量測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

半滑舌鰨肝臟細(xì)胞(HTLC)來源于任國(guó)誠(chéng)等[22]建立的海洋魚類半滑舌鰨的肝臟組織細(xì)胞，該細(xì)胞系是貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，形態(tài)呈纖維樣，傳代穩(wěn)定，細(xì)胞培養(yǎng)條件為24 ℃，全培養(yǎng)基為含15%胎牛血清、1%青鏈霉素抗體、1% bFGF的DMEM-F12培養(yǎng)基。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

配置濃度為1 mol·L-1的PFOS標(biāo)準(zhǔn)品母液，逐級(jí)稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，培養(yǎng)基中DMSO濃度<0.1%。將長(zhǎng)勢(shì)良好的HTLC細(xì)胞以2×105個(gè)·mL-1密度接種于96微孔板中，培養(yǎng)24 h后，移出舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度PFOS(20、100、200、400、1 000 μmol·L-1)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)定無PFOS培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度包括6個(gè)平行，細(xì)胞于24 ℃培養(yǎng)，暴露時(shí)間24、48、72 h。染毒結(jié)束后，每孔加20 μL MTT(5 mg·mL-1)溶液，孵育4 h，再加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)定吸光值。

1.4 透射電鏡實(shí)驗(yàn)

依據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇20 μmol·L-1及200 μmol·L-12個(gè)濃度，對(duì)細(xì)胞染毒24 h后，進(jìn)行電鏡實(shí)驗(yàn)。收集106個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行固定、包埋、超薄切片、染色[23]，利用JEOL JEM-1200EX型電子顯微鏡觀察。

1.5 ROS含量及SOD活性測(cè)定

使用化學(xué)熒光法和四唑鹽WST-1法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量和SOD活性。PFOS(20、100、200、400、1 000 μmol·L-1)染毒24、48、72 h后收集細(xì)胞，PBS重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個(gè)·mL-1，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)平行，對(duì)照組為無PFOS培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)方法參照ROS、SOD及BCA試劑盒。

1.6 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel軟件計(jì)算各組數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析和t檢驗(yàn)，完成對(duì)照組與染毒組之間的顯著性差異分析(*P<0.05差異顯著，**P<0.01差異極顯著)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

不同濃度PFOS作用于HTLC細(xì)胞24 h后，顯微鏡下觀察結(jié)果見圖1。發(fā)現(xiàn)隨著PFOS染毒濃度升高，200、400、1 000 μmol·L-1染毒組中HTLC細(xì)胞不規(guī)則程度增加，貼壁能力下降，細(xì)胞數(shù)量減少，PFOS對(duì)HTLC細(xì)胞具有明顯的增殖抑制效應(yīng)。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在檢測(cè)PFOS細(xì)胞毒性的MTT實(shí)驗(yàn)中，PFOS濃度分別為200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和1 000 μmol·L-1染毒組與對(duì)照組的細(xì)胞活性出現(xiàn)顯著差異(圖2)。當(dāng)PFOS以200 μmol·L-1濃度作用72 h后，HTCL細(xì)胞活性顯著增加(P<0.05)；PFOS濃度為400 μmol·L-1時(shí)，染毒48 h后的細(xì)胞活性與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)，染毒72 h差異極顯著(P<0.01)；在PFOS濃度為1 000 μmol·L-1時(shí)，染毒24、48、72 h后細(xì)胞活性均受到極顯著抑制(P<0.01)。可見，隨著PFOS濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，HTCL細(xì)胞活性變化更顯著(圖2)。

2.3 透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

透射電鏡觀察HTCL細(xì)胞受PFOS作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。空白對(duì)照組HTCL細(xì)胞中線粒體清晰可見，細(xì)胞核及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完整；PFOS濃度20 μmol·L-1染毒組細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整但形態(tài)發(fā)生變化、線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹；PFOS濃度為200 μmol·L-1時(shí)，HTCL細(xì)胞細(xì)胞核并無裂解現(xiàn)象、但細(xì)胞核被擠到細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，胞內(nèi)產(chǎn)生大量脂質(zhì)，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊不清，細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)破壞，損傷較嚴(yán)重。

圖1 不同濃度PFOS染毒24 h后HTLC細(xì)胞形態(tài)變化

圖2 不同濃度PFOS對(duì)HTLC細(xì)胞活性的影響

2.4 ROS含量測(cè)定結(jié)果

不同濃度PFOS作用于HTLC細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)ROS含量變化情況見圖4。HTLC細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨PFOS濃度增加而先升高后降低，隨PFOS作用時(shí)間延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)。染毒24 h結(jié)果表明，HTLC細(xì)胞內(nèi)ROS含量在PFOS濃度20 μmol·L-1染毒組與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)，200、400、1 000 μmol·L-1染毒組ROS含量極顯著降低(P<0.01)；染毒48 h后，400、1 000 μmol·L-1組與對(duì)照組相比ROS含量極顯著降低(P<0.01)；而染毒72 h時(shí)，20 μmol·L-1組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高(P<0.05)，100、200、400、1 000 μmol·L-1染毒組ROS含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

圖3 不同濃度PFOS染毒24 h后電鏡觀察HTCL細(xì)胞結(jié)果(A，B：對(duì)照組；C，D：20 μmol·L-1；E，F(xiàn)：200 μmol·L-1)

2.5 SOD活性測(cè)定結(jié)果

在生物體內(nèi)存在自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，SOD是清除ROS的典型抗氧化酶。PFOS染毒后，HTLC細(xì)胞內(nèi)SOD含量升高(圖5)。PFOS濃度400 μmol·L-1和1 000 μmol·L-1組均具有極顯著差異(P<0.01)。在染毒24 h時(shí)，PFOS濃度200 μmol·L-1組的HTLC細(xì)胞內(nèi)SOD含量與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)，染毒48 h和72 h后，隨PFOS濃度增加，SOD含量顯著升高(圖5)，HTLC細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的劑量依賴效應(yīng)，說明在氧化應(yīng)激過程中，SOD起到了清除HTLC細(xì)胞內(nèi)自由基的作用。

圖4 不同濃度PFOS對(duì)HTLC細(xì)胞ROS含量影響

圖5 不同濃度PFOS對(duì)HTLC細(xì)胞SOD活性影響

3 討論(Discussion)

PFOS具有高蛋白結(jié)合性，易在動(dòng)物的血液和肝臟中蓄積[24-25]，高濃度暴露下，PFOS能影響生物體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，造成生物毒性效應(yīng)[17,26-27]。Liu等[28]研究發(fā)現(xiàn)PFOS濃度大于500 μmol·L-1時(shí)對(duì)原代培養(yǎng)的羅非魚肝臟細(xì)胞具有毒性效應(yīng)，并認(rèn)為目前污染程度對(duì)魚類生殖發(fā)育帶來的風(fēng)險(xiǎn)很小。本研究中HTLC細(xì)胞比羅非魚肝臟細(xì)胞對(duì)PFOS的敏感性高，結(jié)果顯示PFOS濃度為100 μmol·L-1時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，并隨PFOS濃度升高細(xì)胞變形率增多；不同濃度PFOS作用下，細(xì)胞活性表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)高濃度抑制的毒性特點(diǎn)，因此，HTLC細(xì)胞可以作為PFOS對(duì)海洋生物毒性機(jī)理研究的理想模型。在PFOS染毒濃度為20～400 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活性有增加現(xiàn)象，這可能與細(xì)胞為防止毒性產(chǎn)生而啟動(dòng)了DNA修復(fù)過程有關(guān)[29]，端正花等[30]的研究中同樣有PFOS顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖這一現(xiàn)象，并認(rèn)為PFOS可能具有類雌激素風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)染毒濃度為1 000 μmol·L-1時(shí)，PFOS極顯著抑制細(xì)胞活性，Arnaud和Shan等[31-32]研究PFOS對(duì)人體肝癌細(xì)胞毒性時(shí)也得出相似結(jié)論，即較高濃度暴露下PFOS具有明顯的細(xì)胞毒性效應(yīng)。

圖6 PFOS引起細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)及毒性作用過程

綜上所述，本研究通過測(cè)定PFOS對(duì)細(xì)胞活性、細(xì)胞器損傷和氧化損傷相關(guān)酶活性的影響，初步揭示了不同染毒濃度和染毒時(shí)間下PFOS對(duì)海洋魚類細(xì)胞的致毒過程，即低濃度PFOS進(jìn)入HTLC細(xì)胞后，通過與線粒體呼吸鏈輔酶結(jié)合，產(chǎn)生ROS同時(shí)阻礙ATP合成過程，進(jìn)而造成琥珀酸脫氫酶(SDH)含量積累，產(chǎn)生細(xì)胞活性增加的假象，誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)DNA修復(fù)與SOD防御作用維持細(xì)胞代謝平衡，但細(xì)胞將長(zhǎng)期處于由PFOS引起的氧化脅迫狀態(tài)；當(dāng)高濃度PFOS所造成的損傷作用超出細(xì)胞自身修復(fù)防御能力時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS氧化與SOD還原失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，大量ROS破壞生物膜系統(tǒng)及線粒體等細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑受到抑制，細(xì)胞活性降低，并由此引發(fā)細(xì)胞凋亡過程。

致謝：感謝青島黃海水產(chǎn)研究所陳松林研究員贈(zèng)送本實(shí)驗(yàn)所用HTLC細(xì)胞系，感謝孫愛老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助。

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◆

Toxicity Effects of Perfluorooctane Sulfonate (PFOS) on Liver Cells ofCynoglossussemilaevis

Dang Honglei1,2,Na Guangshui2,*,Gao Hui2,Li Ruijing2,Gao Yanfei1,Yao Ziwei2,Zu Guoren1,#

1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China 2.Key Laboratory for Ecological Environment in Coastal Areas of State Oceanic Administration,National Marine Environmental Monitoring Center,Dalian 116023,China

11 November 2014 accepted 3 December 2014

MTT assay and transmission election microscope (TEM) were used to analyze the cytotoxicity of perfluorooctane sulfonate (PFOS) on liver cells of Cynoglossus semilaevis (HTLC).Reactive oxygen species (ROS) and superoxide dismutase (SOD) activity were applied to evaluate the oxidative damage of HTLC exposed to different concentrations of PFOS for 24,48,72 h,respectively.The results indicated that cell activity was promoted under the low concentration of PFOS.However,the activity was inhibited obviously when PFOS concentration increased to 1 000 μmol·L-1(P<0.01).TEM results showed that organelles relevant to metabolism,such as intracellular mitochondria and endoplasmic reticulum,would swell and/or be damaged under the condition of high PFOS concentration in HTLC.ROS contents and SOD activity also displayed significant difference at 20 μmol·L-1and 200 μmol·L-1of PFOS,respectively (P<0.05),indicating that SOD can maintain the cellular homeostasis by removing free radicals induced in the process of oxidative stress caused by PFOS.The results confirmed that the proliferation and metabolic pathways can be inhibited significantly by PFOS in HTLC by the oxidative stress and then the destruction of the biomembrane system of HTLC in marine fish.

PFOS; Cynoglossus semilaevis; liver cell; cytotoxicity; oxidative stress

國(guó)家海洋局海洋公益性科研專項(xiàng)(201105013)；國(guó)家自然科學(xué)基金(21377032)；國(guó)家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放 基金(201506)

黨紅蕾(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲廴疚锒纠恚珽-mail: hongleidang@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: gsna@nmemc.org.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141111002

2014-11-11 錄用日期：2014-12-03

1673-5897(2015)4-162-08

X171.5

A

那廣水(1977-)，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事新型污染物環(huán)境行為及其毒理學(xué)研究。

#共同通訊作者(Co-corresponding author)，E-mail: zugr@dlpu.edu.cn

黨紅蕾,那廣水,高會(huì),等.全氟辛烷磺酸(PFOS)對(duì)半滑舌鰨肝臟細(xì)胞的毒性效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015,10(4): 162-169

Dang H L,Na G S,Gao H,et al.Toxicity effects of perfluorooctane sulfonate (PFOS) on liver cells of Cynoglossus semilaevis [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 162-169 (in Chinese)