王寧莉，張書華，王麗霞

(1.銅川市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，陜西銅川727031；2.西安市閻良區(qū)630醫(yī)院，陜西西安710089)

益母草顆粒中鹽酸水蘇堿與鹽酸益母草堿的含量測定

王寧莉1，張書華1，王麗霞2

(1.銅川市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，陜西銅川727031；2.西安市閻良區(qū)630醫(yī)院，陜西西安710089)

目的 建立測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿含量的HPLC測定法。方法 采用高效液相色譜法，以Kromasil 100-5NH2(Dimensions 250×4.6 mm，5μm)E78824和AgilentTC-C18(2)(250×4.6 mm，5μm)588925-902為色譜柱，檢測波長：192 nm和277 nm，流動相：乙腈-水(80∶20)、乙腈-0.3%庚烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液(24∶76)，流速為1.0 mL/min。理論板數(shù)：按鹽酸水蘇堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000、按鹽酸益母草堿峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。結(jié)果 鹽酸水蘇堿在0.18～1.08 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.99998，平均回收率為99.6%，RSD小于2.0%；鹽酸益母草堿在7～41μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.99998，平均回收率為99.8%，RSD小于2.0%。結(jié)論 該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于益母草中鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿的含量測定。

益母草顆粒；高效液相色譜；鹽酸水蘇堿；鹽酸益母草堿；含量測定

益母草顆粒為婦科經(jīng)產(chǎn)之要藥，主要用于血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后惡露不絕，癥見經(jīng)水量少、淋漓不凈、產(chǎn)后出血時(shí)間過長，產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全癥候；[1]收載于《中國藥典》2010年版一部，其主要成分為鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿等，在《中國藥典》2010年版一部中對其成分鹽酸水蘇堿采用薄層色譜方法進(jìn)行含量測定[2]，因薄層色譜法存在重復(fù)性差，測定不準(zhǔn)確等弊端，采用高效液相色譜法對其鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿進(jìn)行含量測定。

1 儀器與試劑

島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20A檢測器，AY-220型電子天平。鹽酸水蘇堿對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號：110712-201312；鹽酸益母草堿：中國食品藥品檢定研究院，批號：111823-201202；樣品：三金集團(tuán)湖南三金制藥，批號：130304；廣西靈峰藥業(yè)有限公司，批號：1514014；四川逢春制藥有限公司，批號：121017；山東三九制藥有限公司，批號：1003253。其他：乙腈為色譜醇，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；庚烷磺酸鈉為離子對試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸為分析純，天津市化學(xué)試劑有限公司；水為屈臣氏蒸餾水

2 鹽酸水蘇堿的測定方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil 100-5NH2(Dimensions 250×4.6 mm，5μm)E78824，填充劑：氨丙基鍵合硅膠，柱溫：30℃，檢測波長：192 nm，流動相：乙腈-水(80∶20)，[3]流速：1.0 mL/min，理論板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液的制備方法

(1)供試品溶液的制備取益母草顆粒2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，水浴回流2 h，放冷稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，即得。

(2)對照品溶液的制備取鹽酸水蘇堿精密稱定，加70%乙醇，制成每mL含0.6 mg的溶液。供試品圖譜、對照品圖譜見圖1與圖2。

2.3 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、12μL，注入液相色譜儀測定，以進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)(Y)，峰面積為橫坐標(biāo)(X)，計(jì)算回歸方程：Y=3.513-0.013X，r=0.99998，結(jié)果表明鹽酸水蘇堿在0.18～1.08 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 鹽酸水蘇堿供試品圖譜

圖2 鹽酸水蘇堿對照品圖譜

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量吸取鹽酸水蘇堿對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積分別為2677786、2669259、2670157、2677234、2670351、2668357，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.16%(n=6)。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品的供試品溶液，在0、4、8、12、16、20、24 h分別進(jìn)樣，考察測定的結(jié)果在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，7次測定峰面積分別為1500846、1502773、1504149、1497210、1480181、1492944、1487040，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.59%。結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按供試品溶液的制備方法，對同一供試品平行處理6份，分別進(jìn)行結(jié)果測定，測得鹽酸水蘇堿平均含量為0.21mg/g，RSD為0.73%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品6份，每份各2 g，精密稱定，每份均精密加入5 mL濃度為0.01 mg/mL的丹參素鈉對照品溶液，按照2.2中供試品溶液制備的方法進(jìn)行處理，測定并計(jì)算。結(jié)果見表1。

3 鹽酸益母草堿的測定方法

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：AgilentTC-C18(2)(4.6×250 mm，5μm)588925-902，填充劑：十八烷基硅膠鍵合硅膠，柱溫：40℃，檢測波長：277 nm，流動相：乙腈-0.3%庚烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液(24∶76)，流速：1.0 mL/min，理論板數(shù)按鹽酸益母草堿峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。

3.2 溶液的制備方法

(1)供試品溶液的制備取2.2制備的供試品溶液。

表1 鹽酸水蘇堿加樣回收率

(2)對照品溶液的制備取鹽酸益母草堿精密稱定，加70%乙醇，制成每mL含0.035 mg的溶液。供試品圖譜、對照品圖譜見圖3與圖4。

圖3 鹽酸益母草堿供試品圖譜

圖4 鹽酸益母草堿對照品圖譜

3.3 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色譜儀測定，以進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)(Y)，峰面積為橫坐標(biāo)(X)，計(jì)算回歸方程：Y=5.524+0.0004112X，r=0.9998，結(jié)果表明鹽酸水蘇堿在7～41μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 精密度試驗(yàn)

精密量吸取項(xiàng)下鹽酸益母草堿對照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積分別為622686、623264、621769、620936、619751、637564，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.0%(n=6)。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品的供試品溶液，在0、4、8、12、16、20、24 h分別進(jìn)樣，考察測定的結(jié)果在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，7次測定峰面積分別為379460、378401、378375、373123、376914、378270、377424，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.54%。結(jié)果表明樣品在24h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取2.6項(xiàng)下的供試品溶液，分別進(jìn)行結(jié)果測定，測得鹽酸水蘇堿平均含量為0.253 mg/g，RSD為1.3%。

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品6份，每份各3 g，精密稱定，每份均加入濃度為0.268 mg/mL的鹽酸益母草堿對照品溶液5mL，精密量取，按照2.2中供試品溶液制備的方法進(jìn)行處理，測定并計(jì)算。結(jié)果見表2。

表2 鹽酸益母草堿加樣回收率

4 樣品中鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的含量測定

取益母草顆粒待測樣品四批，按照2.2中供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，得到樣品溶液。分別精密量取10μL的對照品溶液和樣品溶液，注入液相色譜儀，測定并計(jì)算。結(jié)果見表3。

表3 樣品中鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的含量

5 結(jié)論

5.1 供試品的制備方法的選擇

分別通過732鈉型陽離子交換樹脂柱洗脫提取[1]、活性炭吸附提取[3]、加熱回流提取[4]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加熱回流提取有效成分含量最佳，所以選用加熱回流對有效成分進(jìn)行提取。同時(shí)對實(shí)驗(yàn)溶劑進(jìn)行了選擇，分別對50%[5]、70%的乙醇進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明70%乙醇提取效果較佳，所以選用70%乙醇進(jìn)行提取。

5.2 色譜柱的選擇

在鹽酸水蘇堿方法研究中對色譜柱進(jìn)行了選擇，采用C18色譜柱不同比例的流動相進(jìn)行分離，鹽酸水蘇堿都無法保留，采用氨基柱進(jìn)行分離，鹽酸水蘇堿在11 min得到了很好的保留，所以選用氨基柱對鹽酸水蘇堿進(jìn)行分離。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益母草顆粒中的有效成分鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的含量可以用HPLC法進(jìn)行質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：272-273.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(第二增補(bǔ)本)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：150-150.

[3]任江劍，徐建中，王志安.HPLC法測定鮮益母草中鹽酸水蘇堿含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17(5)：216-218.

[4]張玉萌，項(xiàng)菲菲.益母草飲片中鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿含量測定[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15(2)：73-74.

[5]吳海林，甄錄旭，方宗華，等.HPLC法測定益母草中鹽酸水蘇堿的含量[J].安徽醫(yī)藥，2008，12(7)：597-598.

HPLC determination of hydrochloric stachydrine and hydrochloric leonurine in motherwort granules

WANGNing-li1,ZHANGShu-hua1,WANGLi-xia2

(1.Tongchuan center food and drug control,Tongchuan 727031,China;2. Xi'an yanliang 603 hospital,Xi'an 710039,China)

Objective To establish a method for content determine of hydrochloric stachydrine and hydrochloric leonurine in motherwort granules.Methods An HPLC method was adopted.The separation was carried out on a Kromasil 100-5NH2(Dimensions 250×4.6 mm,5 μm) E78824 column and a Agilent TC-C18(2)(4.6×250 mm,5 μm) 588925-902 column. The UV detective wavelength was set at 192 nm and 277 nm. Acetonitrile-water (80:20) and acetonitrile-0.3% heptane sulfonate diluted by 0.1% phosphate (24:76) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. Theoretical plate number were below 5000 and 8000 calculated by the curves of hydrochloric stachydrine and hydrochloric leonurine,respectively.Results Good linear relationship between the masses and the peak areas of hydrochloric stachydrine and hydrochloric leonurine in the ranges of 0.18～1.08 mg(r=0.99998) and 7～41 μg(r=0.99998),respectively.The average recovery were 99.6% and 99.8%,respectively and RSD were both less than 2.0%.Conclusion The method is simple,rapid, accurate,precise and reliable for the determination of hydrochloric stachydrine and hydrochloric leonurine in motherwort granules.

Motherwort granules; HPLC; Hydrochloric stachydrine; Hydrochloric leonurine; Assay

王寧莉(1983—)，女，陜西富平人，銅川市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心主管中藥師。

R284.1

A

1672-2639(2015)02-0004-03

2014-09-25；責(zé)任編輯 徐文梅]