王 丹， 陳 濤， 王國卿， 姜 巖

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 江蘇 蘇州 215123)

?

三氯乙烯對人胚胎干細(xì)胞心肌分化的影響和機制*

王 丹， 陳 濤， 王國卿△， 姜 巖△

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 江蘇 蘇州 215123)

目的：探討三氯乙烯(TCE)對人胚胎干細(xì)胞心肌發(fā)育分化的影響。方法：以人胚胎干細(xì)胞H9體外心肌定向分化為模型，分化培養(yǎng)液中添加不同劑量的TCE(分別為處理組100 ppb組，1 ppm組，10 ppm組)以及DMSO(對照組)。對誘導(dǎo)后形成的擬胚體以及不同發(fā)育階段的細(xì)胞進(jìn)行檢測，通過MTT法測定細(xì)胞的生存能力，統(tǒng)計有自主節(jié)律跳動的擬胚體的數(shù)量；流式細(xì)胞儀計數(shù)分析細(xì)胞分化比例；熒光定量PCR檢測心肌特異性基因表達(dá)；并應(yīng)用基因芯片方法初步篩選檢測三氯乙烯對心肌細(xì)胞鈣離子通道相關(guān)的基因表達(dá)的影響。結(jié)果：TCE的三個濃度處理組均未顯示細(xì)胞毒性，但高濃度組明顯抑制向心肌細(xì)胞分化，能產(chǎn)生自主節(jié)律搏動的擬胚體比例顯著降低，同時心肌特異性標(biāo)記物cTnT表達(dá)隨劑量的增加而顯著降低。在具有自主節(jié)律性的擬胚體中，鈣離子通路的相關(guān)基因表達(dá)受到影響。結(jié)論：推測TCE通過降低成熟心肌的比例，以及影響心肌細(xì)胞中鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)來共同導(dǎo)致心臟發(fā)育異常。

三氯乙烯；人胚胎干細(xì)胞；心肌分化；基因表達(dá)；鈣離子通道

人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的具有多向分化潛能的細(xì)胞系，具有自我更新和向外、中、內(nèi)三個胚層細(xì)胞多向分化的特性。本研究室的前期工作顯示：人胚胎干細(xì)胞在生長因子及某些藥物小分子的誘導(dǎo)下能夠定向分化為心肌細(xì)胞,表達(dá)心肌特異性抗原并能夠自主搏動[1]。隨著新檢測手段的發(fā)展以及人源性胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞庫的建立，干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞已發(fā)展成為心衰、心肌缺血等疾病的細(xì)胞移植最佳候選細(xì)胞之一，干細(xì)胞體外心肌分化也越來越多的用于建立心肌分化發(fā)育模型，藥物的心肌毒性篩選以及環(huán)境毒物的檢測等諸方面[2]。

三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)是一種工業(yè)上應(yīng)用廣泛的有機溶劑，具有較強的脫脂作用，主要用作脫脂劑、萃取劑、溶劑，人體可以通過呼吸道、消化道和皮膚吸收,并可在體內(nèi)有一定的蓄積，主要蓄積于肝、腦、心臟等器官[3]。2012年國際癌癥研究組織(IARC)將TCE從2A類(人類可能致癌物)升級為1類(人類致癌物)，其對后代所產(chǎn)生的影響也正在受到關(guān)注。動物實驗表明TCE暴露可導(dǎo)致動物心臟發(fā)育畸形[4，5]。人類流行病學(xué)研究表明孕期接觸TCE與胎兒先天性心臟病風(fēng)險增加有關(guān)[6，7]。但TCE暴露與先心病的因果關(guān)系以及TCE對人胚胎發(fā)育過程中的心肌毒性機制尚未明確。目前在用大、小鼠、雞胚等實驗?zāi)Ｐ偷挠嘘P(guān)TCE產(chǎn)生心肌發(fā)育毒性作用的研究結(jié)果表明：TCE可干擾鈣離子通道相關(guān)基因的表達(dá)[8]。而動物心肌發(fā)育時程、心肌的電生理特點與人有很大的物種差異，因此所得到的結(jié)果是否與人心肌發(fā)育分化相一致尚需進(jìn)一步研究。本實驗以hESCs的心肌細(xì)胞定向分化為模型，通過向培養(yǎng)液中添加不同劑量TCE，觀察TCE對心肌發(fā)育分化的影響，并檢測在此過程中鈣離子信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況，以揭示TCE對于人心肌細(xì)胞分化影響的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人胚胎干細(xì)胞系H9(購自ATCC)，三氯乙烯(TCE)(阿達(dá)瑪斯，中國上海)，DMSO，MTT試劑盒(BOSTER，南京生興生物公司)，RNA試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(biomiga)，Power SYBRGreenPCR MasterMix(上海英濰捷基)，引物設(shè)計合成(蘇州金唯智生物科技有限公司)，BMP4，VEGF，b-FGF，DKK1，SB(全購自R&D systems，上海)，cTnT抗體 (Abcam,上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將hESCs細(xì)胞分為對照組(DMSO組)和TCE處理組，TCE的處理劑量分別為：760 nmol/L(100 ppb)，7.6 μmol/L (1 ppm)，76 μmol/L (10 ppm)，溶于DMSO。所有的處理組和對照組經(jīng)過換算保持DMSO濃度一致，實驗組和處理組的DMSO濃度均不超過0.1%。

1.2.2 hESCs的培養(yǎng) 培養(yǎng)hESCs于KO-DMEM培養(yǎng)液含有20% Knockout 血清替代物，0.1 mmol/L雙抗，2 mmol/L谷氨酰胺，1%(v/v)非必需氨基酸(均購自于Gibco，中國上海)及10 ng/mL b-FGF，置于37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2天換液，4～5 d用膠原酶IV處理傳代。

1.2.3 hESCs的心肌定向分化 定向分化開始前3 d，hESCs培養(yǎng)于鋪被Matrigel膠的6孔板以消除飼養(yǎng)層細(xì)胞的影響。以開始分化記為分化天數(shù)D 0, 依次類推，前7 d進(jìn)行擬胚體懸浮培養(yǎng)。分化D 0到D 3，添加BMP 42 ng/ml和b-FGF 5 ng/ml，分化D 4到D 7添加DKK1(150 ng/ml) VEFG(10 ng/ml)，其中D 4和D 5補加SB 5.4 μmol/L。D 7天后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)直至D 21，光鏡觀察自主節(jié)律搏動擬胚體的出現(xiàn)。

1.2.4 細(xì)胞活性測定 收集分化第21天的心肌細(xì)胞以及未分化的hESCs，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度(5 000 cells/well，96孔板鋪板，按照分組設(shè)計添加各自TCE濃度的培養(yǎng)液，5%CO2,37℃孵育48 h，每孔加入10 μl MTT染色液，培養(yǎng)4 h，再加入100 μl Formanzan溶解液，置搖床上30 min使之混合均勻。用酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)570 nm測定吸光度。

1.2.5 基因表達(dá)檢測 收集對照組和不同TCE劑量處理組分化發(fā)育的心肌細(xì)胞，提取總RNA，定量1 μg 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)參數(shù)為25℃ 5 min,40℃ 15 min,85℃ 5 min,后置于-80℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測心肌分化過程中相關(guān)基因：Nanog,T，ISL-1，cTnT以及調(diào)節(jié)鈣離子相關(guān)基因如Serca2A和Cav1.2的表達(dá)。以cDNA為模板，應(yīng)用引物進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)，95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 60 s，共40個循環(huán)，反應(yīng)體系20 μl。實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增反應(yīng)(美國ABI7500)。

1.2.6 流式細(xì)胞分析分化比例 在分化的第21天，收集不同處理組和對照組的細(xì)胞，消化洗滌后，加入甲醛固定20 min，而后加入預(yù)冷的甲醇溶液(9∶1)破膜，充分洗滌后加入一抗cTnT避光孵育1 h，洗滌3次后加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG于室溫孵育30 min，洗滌后加入0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國)檢測cTnT陽性細(xì)胞率，并用Flow Jo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 心肌鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)檢測 應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測心肌鈣離子通道相關(guān)基因Serca2和Cav1.2的表達(dá)。收集分化第21天的細(xì)胞，用TRIzol法提取總RNA，定量2 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再用Cyanine-3-CTP進(jìn)行熒光標(biāo)記，進(jìn)行雜交反應(yīng)，用激光共聚焦熒光掃描儀(Leica，德國)進(jìn)行信號檢測，ANOVA分析結(jié)果。選取表達(dá)差異高于2倍的目的基因進(jìn)一步進(jìn)行熒光定量PCR驗證。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 胚胎干細(xì)胞向心肌定向分化

隨著分化培養(yǎng)時間的推移可以觀測到hESC細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化如圖1所示，依次經(jīng)過多能干細(xì)胞期、擬胚體懸浮期以及自發(fā)節(jié)律性搏動的貼壁擬胚體形成期。除形態(tài)學(xué)變化外，進(jìn)一步分析在分化過程中階段特異性基因的表達(dá)。在細(xì)胞因子的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下由多能性基因(Nanog)的下調(diào)表達(dá)起始心肌分化，而后按時間推移，依次檢測到中胚層特異性基因(T)和心肌前體特異性基因(ISL-1)顯著上調(diào)，在分化第21天，自主搏動的擬胚體數(shù)量達(dá)到最大，此時，心肌特異性基因cTnT的表達(dá)顯著升高(表1，P<0.05，P<0.01)。

Fig. 1 Morphological appearance of phase contrast images of undifferentiated cells, embryoid bodies and beating clusters(Bar=100 μm)

Tab. 1 Analysis of gene expression level during cardiac differetiation

GroupNanogTISL?1cTnTDay01111Day70．62±0．21?5．32±0．40??5．53±1．50?2．44±0．67Day140．26±0．01??2．58±0．25?12．48±2．77??29．23±5．80?Day210．13±0．08??0．09±0．021．78±0．02107．27±12．60??

*P<0.05，**P<0.01vsDay 0 group

2.2 TCE對細(xì)胞的毒性作用

根據(jù)環(huán)境組織對于飲用水中TCE的測定以及疾病相關(guān)性分析，并參考實驗動物和其他細(xì)胞體外培養(yǎng)致毒實驗，本實驗選定TCE的作用濃度范圍為760 nmol/L(100 ppb)，7.6 μmol/L(1 ppm)和76 μmol/L(10 ppm)。MTT比色法顯示所檢測的濃度對于未分化的胚胎干細(xì)胞和終末分化的心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性均不產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性作用，在10 ppm對于心肌細(xì)胞有一定的刺激增殖影響，但差異不顯著(圖2)。該結(jié)果說明所測劑量的TCE不影響細(xì)胞活性，因此后續(xù)的分化實驗中所研究的TCE致毒機制為非細(xì)胞毒性致毒。

2.3 TCE對hESCs心肌定向分化的影響

該研究沿用國際標(biāo)準(zhǔn)EST評價指標(biāo)，以自發(fā)節(jié)律性搏動的擬胚體形成作為成功的心肌分化的功能標(biāo)記。對照組在擬胚體貼壁培養(yǎng)的第2天開始出現(xiàn)自發(fā)節(jié)律性搏動，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，觀測到的擬胚體搏動數(shù)目增加，在第21天時，陽性搏動比例達(dá)到高峰。在TCE 1 ppm和10 ppm處理組中，自發(fā)搏動擬胚體發(fā)生的時間較對照組向后推移，同時，這兩個劑量組顯著抑制了自發(fā)節(jié)律搏動擬胚體的陽性率(對照組38.33%；100 ppb 組35.33%；1 ppb組9.33%；10 ppb組8.67%，P<0.05，圖3A)。以心肌特異性標(biāo)記cTnT為檢測抗體，流式細(xì)胞檢測顯示TCE隨劑量增加對心肌分化的抑制程度提高(P<0.05，P<0.01，圖3B)。

Fig. 2 Effect of TCE on cellular viability (9 different biological replicates per each condition)

Fig. 3 Differentiation inhibition of hESCs following continuous TCE exposure during cardiac differentiation A: Spontaneous beating percentage during the differentiation period; B: Flow cytometry analysis of cTnT positive cells; hESCs: Human embryonic stem cells; TCE: Trichloroethylene**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs100 ppb;△P<0.05vs1 ppm

2.4 TCE對心肌分化的基因表達(dá)影響

胚胎干細(xì)胞在BMP4和Actinin及其Wnt信號通路細(xì)胞因子的共同作用下啟動向心肌細(xì)胞的定向分化。TCE對于全能性基因Nanog、中胚層形成相關(guān)基因T、心肌前體細(xì)胞基因ISL1沒有顯著影響。但TCE能夠顯著影響cTnT的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，說明TCE影響心肌細(xì)胞從心肌前體期到成熟心肌分化的轉(zhuǎn)變(P<0.05，P<0.01，表2)。

Tab. 2 Q-PCR analysis of the effect of TCE induced cardiac development related gene expression changes

GroupNanogTISL?1cTnTControl1111100ppb1．1±0．220．83±0．100．95±0．030．95±0．021ppm0．93±0．170．95±0．050．83±0．080．78±0．02?10ppm0．96±0．130．94±0．010．93±0．120．39±0．13??

#P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.5 TCE對心肌鈣離子通道相關(guān)基因表達(dá)的影響

將具有自主性節(jié)律搏動的心肌細(xì)胞進(jìn)行芯片分析，發(fā)現(xiàn)這些能夠自主搏動的細(xì)胞中與鈣離子通道相關(guān)的基因數(shù)目總體上呈現(xiàn)下調(diào)。由于基因芯片的分辨率較低，我們又選取了與鈣瞬變相關(guān)的兩個重要基因Serca2基因和Cav1.2進(jìn)一步驗證顯示：Serca2基因和Cav1.2基因轉(zhuǎn)錄水平在TCE 1 ppm和TCE 10 ppm組顯著受到抑制(P<0.05，圖4)。

Fig. 4 Q-PCR analysis of Ca2+signaling related genes expression by TCE treatment TCE: Tichloroethylene*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs100 ppb group

3 討論

先天性心臟病是先天性畸形疾病中最常見的一種，是由于胚胎發(fā)育時期心臟及大血管的形成障礙或發(fā)育異常而引起的解剖功能異常，主要由環(huán)境因素和遺傳因素或者兩者共同作用而引起。已有報道顯示人懷孕期TCE暴露與先天性心臟病具有相關(guān)性，但有關(guān)具體的分子機制尚未見報道[6,7]。動物研究中表明TCE主要通過干擾胚胎發(fā)育相關(guān)基因以及鈣離子通路蛋白影響心肌發(fā)育[4,8]，但人中尚無類似報道。胚胎干細(xì)胞在體外可以長期培養(yǎng)傳代，并能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下誘導(dǎo)成為包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞類型，是目前發(fā)展起來的對環(huán)境致毒物進(jìn)行安全評價的較好動物替代模型[9]。與傳統(tǒng)的實驗動物研究相比，進(jìn)行胚胎干細(xì)胞心肌定向為模型其優(yōu)點在于靈敏度高，可以檢測發(fā)育過程中不同時期的基因表達(dá)細(xì)微變化，另外，由于心肌細(xì)胞的作用與竇房結(jié)，心房，心室的功能極其相似，因此可以反映整個組織的發(fā)育特性。

本研究利用人胚胎干細(xì)胞體外心肌定向分化模型,探討TCE對于心肌發(fā)育和分化的影響。Dawson在雞胚中的研究顯示TCE暴露減少了心內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致瓣膜形成障礙，但TCE并不影響心肌細(xì)胞的分化[10]。本文的結(jié)果顯示TCE顯著抑制心肌細(xì)胞的分化，這與動物研究不一致，推測這個與染毒劑量有關(guān)，更與不同物種對于毒物的反應(yīng)差異性有關(guān)。為排除細(xì)胞系之間差異，后期需要對更多的人多能干細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)研究。另外，本文從基因表達(dá)的水平初步發(fā)現(xiàn)TCE并不影響全能階段和中胚層以及前體細(xì)胞的分化，但是影響心肌細(xì)胞分化。推測TCE影響心肌前體細(xì)胞到心肌細(xì)胞的分化過程，是否影響心肌前體細(xì)胞增殖/分化平衡或者心肌/內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育譜系改變，其確切機制尚須進(jìn)一步研究。外鈣內(nèi)流引發(fā)的內(nèi)鈣離子釋放是引起心肌細(xì)胞收縮的關(guān)鍵因素，動物模型研究顯示TCE可干擾肌漿網(wǎng)鈣ATP酶以及鈣離子電壓門控通道相關(guān)基因的表達(dá)[8]。本實驗利用人胚胎干細(xì)胞體外定向分化模型研究表明：TCE能夠顯著的降低鈣離子通道相關(guān)基因的表達(dá)，包括(Serca2A,Cav1.2等)，這一結(jié)果提示TCE可能通過干擾心肌細(xì)胞鈣離子通道的開放而影響心肌細(xì)胞自主節(jié)律性搏動。

綜上所述，本研究以人胚胎干細(xì)胞為模型揭示了TCE可能通過影響心肌細(xì)胞定向分化，以及干擾心肌細(xì)胞鈣離子通道基因表達(dá)介導(dǎo)心臟發(fā)育毒性作用。該模型的應(yīng)用符合現(xiàn)代毒理替代方法的發(fā)展方向；對TCE等環(huán)境致毒物作用機理的深入研究對于未來先天性心臟病的預(yù)防和相關(guān)藥物的開發(fā)治療提供基礎(chǔ)，具有一定的應(yīng)用前景。

[1] Jiang Y, Habibollah S, Tilgner K，etal. An induced pluripotent stem cell model of hypoplastic left heart syndrome (HLHS) reveals multiple expression and functional differences in HLHS-derived cardiac myocytes[J].StemCellsTranslMed， 2014, 3(4): 416-423.

[2] Matsa E, Denning C. In vitro uses of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes[J].JCardiovascTranslRes, 2012, 5(5)： 581-92.

[3] 胡明霞. 三氯乙烯的毒理學(xué)研究新進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊, 2001, 28(3)： 155-158.

[4] Collier JM, Selmin O, Johnson PD,etal. Trichloroethylene effects on gene expression during cardiac development[J].BirthDefectsResAClinMolTeratol, 2003, 67(7): 488-495.

[5] Loeber CP, Hendrix MJ, Diez De Pinos S,etal. Trichloroe thylene: a cardiac teratogen in developing chick embryos [J].PediatrRes, 1988. 24(6): 740-744.

[6] Chiu WA, Jinot J, Scott CS,etal. Human health effects of trichloroethylene:key findings and scientific issues[J].EnvironHealthPerspect, 2013, 121(3)： 303-311.

[7] Yauck JS, Malloy ME, Blair K,etal. Proximity of residence to trichloroethylene-emitting sites and increased risk of offspring congenital heart defects among older women[J].BirthDefectsResAClinMolTeratol, 2004, 70(10)： 808-814.

[8] Caldwell PT, Thorne PA, Johnson PD,etal. Trichloroethylene disrupts cardiac gene expression and calcium homeostasis in rat myocytes[J].ToxicolSci, 2008， 104(1): 135-143.

[9] Suzuki N, Ando S, Sumida K,etal. Analysis of altered gene expression specific to embryotoxic chemical treatment during embryonic stem cell differentiation into myocardiac and neural cells[J].JToxicolSci, 2011，36(5)： 569-585.

[10]Dawson BV, Johnson PD, Goldberg SJ,etal. Cardiac teratogenesis of trichloroethylene and dichloroethylene in a mammalian model[J].JAmCollCardiol, 1990, 16(5)： 1304-1309.

The effects of trichloroethylene on cardiac differentiation in human embryonic stem cells and its mechanisms

WANG Dan, CHEN Tao, WANG Guo-qing△, JIANG Yan△

(Medical Department, Soochow University, Suzhou 215123, China)

Objective: To explore the effects of trichloroethylene (TCE) on cardiac developmental differentiation in human embryonic stem cells. Methods: In this study, based on the human embryonic stem cells in vitro cardiac differentiation assay, we investigated the potential effect of TCE exposure on the cardiac toxicity in embryo development. Human embryonic stem cells were treated with TCE at different concentrations of 100 ppb, 1 ppm, and 10 ppm and dimethyl sulfoxide(DMSO)treated as control. The MTT assay was performed to examine the cytoplasmic toxicity of TCE exposure. The beating percentages were recorded and the expression of cardiac specific gene was evaluated by PCR or flow cytometry. Also, real time PCR was performed to verify the micro array analysis on the expression level changes of genes which were involved in the Ca2+signal pathways. Results: Compared with the control group, there was no significant difference in cell viability when cells were treated with TCE at the concentrations of 100 ppb, 1 ppm, and 10 ppm. However, TCE could inhibit the expression of cTnT protein in a concentration-dependant manner. And the most interestingly, TCE significantly inhibited the cardiac differentiation characterized by the decrease beating percentages. Genes involved in Ca2+signaling pathway were severely disrupted by TCE. Conclusion: TCE inhibited the cardiac specific differentiation of human embryonic stem cell and at the meanwhile the genes responsible for Ca2+signaling pathway were severely disrupted, which could contribute the severe effects of TCE cardiotoxicity.

trichloroethylene； human embryonic stem cells； cardiac differentiation； gene expression； calcium channel

國家自然科學(xué)基金項目(81300143)；中國博士后基金(2013M541718)

2014-11-13

2015-03-09

R991

A

1000-6834(2015)03-216-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.006

△【通訊作者】Tel： 0512-65880127; E-mail： wangguoqing@suda.edu.cn, yjiang@suda.edu.cn