潘瑩瑩， 徐 潔， 王曉慧， 毛挺挺， 謝浩煌， 張宏宇， 肖 健， 李校， 姜麗萍△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院, 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科， 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在大鼠壓瘡深部組織損傷中的作用*

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院, 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科， 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

目的：觀察壓瘡大鼠深部組織損傷(DTI)中肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)因子表達(dá)的變化，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在壓瘡深部組織損傷中的作用。方法：健康雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常(Con)組，模型(Model)組，實(shí)驗(yàn)組(生理鹽水(NS)組與4-苯基丁酸(PBA)組)，實(shí)驗(yàn)組按觀察時(shí)間點(diǎn)又分為4 d，7 d，14 d，21 d四組(n=5)。PBA組于造模結(jié)束后2 ml生理鹽水溶解PBA灌胃，隔天1次；NS組予等量生理鹽水灌胃。于各時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，收集受壓肌肉組織。HE染色觀察肌肉組織病理變化；TUENL染色觀察細(xì)胞凋亡；免疫組化檢測(cè)ERS分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP(CHOP)、凋亡酶12(Caspase 12)的水平。結(jié)果：HE染色顯示與Con組相比，各實(shí)驗(yàn)組肌肉組織出現(xiàn)不同程度病理退化表現(xiàn)，PBA組與NS組相比，損傷程度有所緩解，新生肌纖維融合更快；TUNEL結(jié)果顯示受壓各組較正常組細(xì)胞凋亡數(shù)增加，于4 d達(dá)到高峰，以后逐漸下降，PBA干預(yù)后細(xì)胞凋亡有所減少(P<0.05)；免疫組化結(jié)果顯示：肌肉組織NS組GRP78、CHOP、Caspase 12蛋白表達(dá)在4 d達(dá)到高峰后逐漸下降。 NS組各蛋白在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均明顯高于PBA組(P<0.05)。結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與壓瘡深部組織損傷病理進(jìn)程，其相關(guān)機(jī)制可能與CHOP、Caspase 12介導(dǎo)的的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；壓瘡；深部組織損傷；4-苯基丁酸；大鼠

壓瘡是脊髓損傷患者、心血管疾病患者等長(zhǎng)期

臥床或靜坐患者常見的并發(fā)癥，近年發(fā)病率居高不下。探索壓瘡的發(fā)病機(jī)制，可能為壓瘡新的治療策略和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，具有重要的臨床意義。壓瘡的發(fā)生發(fā)展起源于深部組織損傷(deep tissue injury，DTI)，主要由肌肉組織逐漸向皮膚全層發(fā)展[1]，因此肌肉組織的病理變化在壓瘡深部組織損傷中更具研究意義。研究顯示，肌肉組織細(xì)胞凋亡參與了壓瘡進(jìn)展，可能是啟動(dòng)壓瘡發(fā)生和促使其不可逆發(fā)展的潛在關(guān)鍵因素[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下最初的反應(yīng)之一，應(yīng)激持續(xù)過強(qiáng)或過久時(shí)，可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引發(fā)組織損傷[2]。4-苯基丁酸(4-phenybutyric acid，4-PBA)是一種經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑，可明顯降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，抑制細(xì)胞過度凋亡，保護(hù)細(xì)胞功能[3]。壓瘡病變中肌肉組織發(fā)生ERS的具體分子作用機(jī)制及與組織損傷的關(guān)系，目前尚不清楚。因此，本研究通過建立大鼠壓瘡深部組織損傷模型，應(yīng)用4-PBA觀察ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，以期從正反兩面探討壓瘡深部組織損傷中ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與試劑

健康雄性SD大鼠(購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SOXK(滬)2007-0005)，體重350～400 g，分籠喂養(yǎng)，自由飲食。4-PBA購自Sigma公司；TUNEL試劑盒購自碧云天公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78 sc-1050),C/EBP homologous protein(CHOP, SC-575)購自santa cruz公司,Caspase 12 (ab-62464) 購自abcam公司。1.1.1 動(dòng)物模型制備及方法 將50只雄性SD大鼠分為正常(Con)組，模型(Model)組，實(shí)驗(yàn)組(NS組與PBA組)，實(shí)驗(yàn)組按照不同觀察時(shí)間又分為4 d、7 d、14 d、21 d四組(n=5)。采用謝浩煌等[4]的方法復(fù)制大鼠壓瘡深部組織損傷模型，在大鼠兩側(cè)后肢上下側(cè)給予同樣的永磁(直徑0.8 mm，厚4 mm，2.4 g，磁通量3 500高斯)，經(jīng)壓力檢測(cè)顯示(5.0±2.0)mm厚度的條件下作用于大鼠受壓組織的壓強(qiáng)為40 kPa。施壓12 h后放松12 h為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)3個(gè)循環(huán)，施壓時(shí)造成受壓處血管壓迫缺血，放松時(shí)血液灌流形成再灌注。模型(Model)組：3個(gè)循環(huán)結(jié)束后即可處死。 PBA組：受壓3個(gè)循環(huán)后立即予4-苯基丁酸(1 g/kg，課題組前期摸索并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道得出該濃度)灌胃，隔天1次，4 d組為造模結(jié)束后第4 d處死，以此類推，觀察至21 d。NS組：造模結(jié)束后給予等量生理鹽水灌胃，其余操作同PBA組。

1.1.2 標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，在冰上迅速切取各組受壓中心肌肉組織(約500 mg)，于4℃冰生理鹽水中快速洗去血液，用濾紙吸干水分并且剪碎后于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。另取相同部位受壓肌肉組織(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm), 4℃生理鹽水洗凈血液后，4%多聚甲醛-PBS液固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片5 μm厚，分別用于HE染色、免疫組化染色、TUNEL染色分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HE染色 組織常規(guī)脫蠟，梯度透明，蘇木精-伊紅染色，用Nikon(TE2000-U)顯微鏡觀察，NIS Elements圖像采集軟件采集圖像，觀察不同時(shí)間點(diǎn)受壓肌肉組織病理學(xué)變化。

1.2.2 SABC免疫組化 甲醛固定和石蠟包埋肌肉組織樣本切片、脫蠟、透明。采用SABC法,常規(guī)設(shè)立陰性對(duì)照(用抗體稀釋液PBS代替一抗)。3% H2O2處理后熱修復(fù)抗原，5% BSA封閉，CHOP 一抗?jié)舛葹?1∶100，GRP78 一抗?jié)舛葹?1∶100，Caspase 12 一抗?jié)舛葹?1∶1 000，于 4℃冰箱過夜。滴加二抗： 1% BSA 稀釋二抗， 37℃恒溫箱放置2 h。CHOP二抗?jié)舛葹?∶200，GRP78 二抗?jié)舛葹?1∶200，Caspase 12 二抗?jié)舛葹?1∶2 000，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下進(jìn)行定性觀察。陽性結(jié)果為棕黃色顆粒沉積，陰性對(duì)照顯示胞核及胞膜呈藍(lán)色，胞漿及整片組織呈淡藍(lán)色背景。每張組織切片在×20物鏡下觀察5個(gè)視野(不重復(fù))，并作圖像采集，統(tǒng)計(jì)各張切片單位面積內(nèi)(mm2)CHOP、GRP78、Caspase 12 陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 TUNEL染色 采用碧云天公司的TUNEL法凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)受壓肌肉組織細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。光鏡下觀察染色結(jié)果并拍照計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察受壓肌肉組織形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠肌纖維胞核大小均勻，排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，無明顯的炎性細(xì)胞浸潤。Model組，肌纖維排列疏松，萎縮變性，間質(zhì)成分多，大多細(xì)胞核萎縮消失，可見肌細(xì)胞明顯壞死；4 d組骨骼肌結(jié)構(gòu)已不可見，肌核內(nèi)移，大量炎性細(xì)胞浸潤；7 d組肌肉組織仍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，肌肉組織開始修復(fù)；14 d組仍有部分中性粒細(xì)胞，肌衛(wèi)星細(xì)胞融合成一個(gè)較大的肌細(xì)胞；21 d組可見肌肉結(jié)構(gòu)，肌細(xì)胞排列趨于整齊，肌間隙較為緊密。PBA組肌肉恢復(fù)較NS組更快，4 d炎癥細(xì)胞浸潤較NS組明顯減少，7 d可見更多肌衛(wèi)星細(xì)胞，14 d可見較為明顯的骨骼肌結(jié)構(gòu)，21 d基本恢復(fù)。(圖1)

Fig. 1 Histological changes in compressed muscle tissue from different groups (HE×200) Con： Control； PBA： Phenybutyric acid

2.2 各組大鼠肌肉組織中細(xì)胞凋亡情況

TUNEL染色的陽性細(xì)胞胞漿不著色，胞核被染成棕褐色，核固縮，染色質(zhì)濃縮。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Con組可見少數(shù)陽性顆粒，受壓各組與正常組相比細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，NS組肌肉組織中凋亡細(xì)胞數(shù)于4 d表達(dá)最高，以后逐漸下降，14 d時(shí)檢測(cè)幾乎不表達(dá)。PBA干預(yù)后可見4 d時(shí)凋亡細(xì)胞大量減少(圖2，表1，P<0.05)。

Fig. 2 Number of positive cells (TUNEL X 200) Con： Control； PBA： Phenybutyric acid

Tab.

Con： Control； PBA： Phenybutyric acid

*P<0.05vsNS group

2.3 各組肌肉組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)變化

選取各時(shí)間點(diǎn)受壓組織切片進(jìn)行GRP78、CHOP、Caspase 12蛋白免疫組化法染色，棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。結(jié)果顯示Con組和Model組有少量表達(dá)，NS組造模后4 d GRP78、CHOP、Caspase 12表達(dá)明顯增加并達(dá)到高峰，以后逐漸下降。PBA組各時(shí)間點(diǎn) GRP78、CHOP、Caspase 12表達(dá)相比較NS組有明顯減少(圖3，表2、表3、表4，P<0.05，P<0.01)。

Fig. 3 Immunohistochemistry for GRP78, CHOP and cleaved Caspase-12 in compressed muscle(×200) Con： Control； PBA： Phenybutyric acid； GRP78： Glucose regulated protein 78; CHOP： C/EBP homologous protein

3 討論

近年研究[5]證明缺血再灌注損傷是壓瘡發(fā)生的重要分子機(jī)制，其誘導(dǎo)的DTI可能是啟動(dòng)壓瘡病理變化的機(jī)制之一。缺血再灌注損傷引起細(xì)胞氧自由基產(chǎn)生、鈣離子超載等病理環(huán)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，造成組織不可逆性損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)的凋亡途徑與缺血缺氧誘發(fā)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[6]。和其他組織不同，骨骼肌細(xì)胞富含豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)即肌漿網(wǎng)[7]，負(fù)責(zé)儲(chǔ)存和釋放鈣離子，在老年性肌萎縮、多肌炎等病理生理過程中，骨骼肌有不同程度的ERS活化[8，9]。因此我們推測(cè)，ERS可能參與了壓瘡深部組織損傷的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制可能與其介導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用4-PBA干預(yù)壓瘡大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，觀察ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路在壓瘡深部組織損傷中的表達(dá)變化，探討細(xì)胞凋亡在壓瘡形成過程中的潛在作用，尋找早期干預(yù)的分子靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)HE和 TUNEL結(jié)果表明受壓后肌肉組織缺血、缺氧，導(dǎo)致細(xì)胞Ca2+超載、自由基產(chǎn)生增多，使受壓肌肉組織出現(xiàn)逐步退化病理變化，出現(xiàn)肌纖維溶解斷裂、玻璃樣變，大量骨骼肌細(xì)胞凋亡。4 d后，隨著缺血、缺氧、氧化應(yīng)激等狀態(tài)的改善，肌肉組織炎癥逐漸消退，可觀察到肌肉再生并逐漸融合。這與Fang Lin等[10]研究結(jié)果一致。PBA組大鼠肌肉組織的細(xì)胞凋亡明顯減少，光鏡下可見肌肉組織損傷減輕，表明長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)激引起錯(cuò)誤折疊蛋白聚集，持續(xù)性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了壓瘡中的組織損傷。

Tab.

Con： Control； PBA： Phenybutyric acid； GRP78： Glucose regulated protein 78

*P<0.05,**P<0.01vsNS group

Tab.

Con： Control； PBA： Phenybutyric acid； CHOP： C/EBP homologous protein

**P<0.01vsNS group

Tab.

Con： Control； PBA： Phenybutyric acid； CHOP： C/EBP homologous protein

*P<0.05,**P<0.01vsNS group

為了進(jìn)一步探討ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、Caspase 12的表達(dá)情況。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器，具有幫助未折疊蛋白正確折疊或促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白正確折疊的作用，是ERS保護(hù)性反應(yīng)的重要標(biāo)志[11]，同時(shí)也是下游通路激活的信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)中，GRP78蛋白在受壓后Model組高于Con組，表明骨骼肌受壓后引起ERS穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)反應(yīng)，啟動(dòng)生存性適應(yīng)以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，此時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響不大；隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，4 d組GRP78蛋白水平達(dá)到最高，以后呈遞減趨勢(shì)，提示隨著骨骼肌細(xì)胞損傷加重，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量未折疊蛋白聚集穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的能力逐漸下降，表明GRP78蛋白的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用是有一定限度的。PBA給藥后與NS各組相比，GRP78表達(dá)明顯下降，表明PBA可從源頭控制ERS水平。

研究證實(shí)，ERS啟動(dòng)的細(xì)胞反應(yīng)開始是以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞存活為目的[12]；但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過強(qiáng)時(shí)，促凋亡機(jī)制占主導(dǎo)，能夠獨(dú)立地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為CHOP、Caspase 12蛋白的高表達(dá)。CHOP是ERS促凋亡途徑中的重要信號(hào)分子，CHOP蛋白在多條ERS介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中充當(dāng)共同的下游凋亡信號(hào)分子，因此，CHOP蛋白的表達(dá)在一定程度上反應(yīng)了ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平[13]；Caspase 12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性的凋亡因子，對(duì)ERS的凋亡反應(yīng)最為敏感[14]，二者介導(dǎo)了兩條ERS誘導(dǎo)的凋亡途徑，在燒傷[7]、心肌炎[15]等疾病的發(fā)生發(fā)展起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)各組中的CHOP、Caspase 12的表達(dá)明顯高于Con組，表明壓瘡深部組織損傷中存在ERS；二者水平于4 d時(shí)達(dá)到高峰，以后逐漸下降，同時(shí)伴有細(xì)胞凋亡數(shù)增多，表明缺血/再灌注損傷引起細(xì)胞的長(zhǎng)期應(yīng)激，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、鈣離子超載，隨著骨骼肌細(xì)胞進(jìn)一步受損，胞質(zhì)內(nèi)豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)打亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，信號(hào)由促生存轉(zhuǎn)為促凋亡，通過CHOP、Caspase 12途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成組織損傷。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)趨勢(shì)與林可[16]，褚萬立等[7]研究結(jié)果一致，提示CHOP和Caspase 12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑參與了壓瘡肌肉組織細(xì)胞凋亡的過程，并在一定程度上對(duì)骨骼肌細(xì)胞凋亡起到了促進(jìn)作用，導(dǎo)致壓瘡的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用4-PBA處理后，各時(shí)間點(diǎn)受壓肌肉組織中ERS凋亡相關(guān)蛋白CHOP、Caspase 12的表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡水平減輕，說明PBA可在一定程度上減輕ERS帶來的組織損傷，也從反面證明ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在壓瘡深部組織損傷病變進(jìn)程中起重要作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ERS關(guān)鍵信號(hào)因子GRP78、CHOP、Caspase 12參與了壓瘡深部組織損傷的發(fā)生發(fā)展。4-PBA能在一定程度上通過抑制 ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡，從而對(duì)受壓組織起到保護(hù)作用。調(diào)控受壓肌肉組織的ERS水平，可能是改善壓瘡病理變化的重要靶點(diǎn)，為今后的研究提供了理論依據(jù)。

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The role of cell apoptosis mediated by endoplasmic reticulum stress (ERS) of deep tissue injury of pressure ulcer of rats

PAN Ying-ying1, XU Jie2, WANG Xiao-hui1, MAO Ting-ting1, XIE Hao-huang1, ZHANG Hong-yu3, XIAO Jian3, LI Xiao-kun3, JIANG Li-ping1△

(1. Collage of Nursing, 2. Department of Cerebral Surgey, the First Affilicated Hospital, 3. College of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To observe the the expression of endoplasmic reticulum stress (ERS) related factors in deep tissue injury (DTI) at pressure ulcer rat and to investigate the ERS mechanism of DTI in muscle tissue and protective effect of 4- phenylbutyric acid (4-PBA) in local tissue. Methods: Fifty male SD rats were randomly devided into control group, model group, experimental group NS group and PBA group, the experimental groups were divided into 4 d, 7 d, 14 d and 21 d group according to the observation time (n=5). Rats in the PBA group were administrated with gastric perfusion of 4-PBA after the modeling; the NS group was given normal saline of the same quantity.Using HE staining to observe morphologic character. The expression of glucose regulated protein 78( GRP78), CHOP, Caspase 12 were detected by immunohistochemical staining. Cell apoptosis was detected by TUNEL assay. Results: HE staining results showed that each group demonstrated compression injury compared with control group: cellular swelling, ompaction of nuclear, and apoptosis in muscle tissue. The new muscle fiber in 4-PBA group fused faster than those in NS group. The number of TUNEL positive cells peaked at 4 day after compression, then got decreased on day 7 in muscle tissue, apoptosis positive cells were diminished after 4-PBA treatment. The immunohistochemical staining results showed that the expression of protein GRP78, CHOP, Caspase 12 peakd 4 d after modeling and decreased gradually. The GRP78, CHOP, Caspase 12 protein expression were significantly higher than those of PBA group at all time points (P<0.05). Conclusion: Cell apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress took part in deep tissue injury resulting of pressure ulcer, which mechanism might be related to reducing apoptosis mediated by CHOP, Caspase 12.

endoplasmic reticulum stress; apoptosis; pressure ulcer; deep tissue injury; 4-PBA

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372064)

2014-12-29 【修回日期】2015-03-04

R632.1

A

1000-6834(2015)05-396-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.004

△【通訊作者】Tel： 0577-86689836； E-mail： jlp@wmu.edu.cn