余孝海，李 艷，丁 揚，唐志強，汪金麗，范一菲，程文慧，鐘明奎

(安徽醫(yī)科大學生理學教研室，安徽 合肥 230032)

室旁核血管緊張素Ⅱ在慢性間歇性低氧誘發(fā)大鼠高血壓中的作用及機制

余孝海，李 艷，丁 揚，唐志強，汪金麗，范一菲，程文慧，鐘明奎

(安徽醫(yī)科大學生理學教研室，安徽 合肥 230032)

目的 研究下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)中血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)在慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)誘發(fā)高血壓大鼠中的作用及機制。方法 將♂SD大鼠隨機分為對照(Sham)組和慢性間歇性低氧(CIH)組(每日8 h，連續(xù)15d)。用無創(chuàng)套尾法測大鼠尾動脈收縮壓(SBP) 和動脈插管法記錄平均動脈壓(MAP)、心率(HR)，用立體定位儀進行 PVN 核團定位并微量注射藥物，用Western blot測定PVN中Ang Ⅱ水平及Ang Ⅱ 1型受體(AT1R)蛋白表達。結(jié)果 與Sham組相比，CIH 組大鼠PVN內(nèi)Ang Ⅱ水平及AT1R表達明顯增加。雙側(cè)PVN內(nèi)微量注射Ang Ⅱ(0.03、0.3、3 nmol)，均可劑量依賴性地升高Sham組和CIH組大鼠MAP，且CIH大鼠MAP升高更明顯；雙側(cè)PVN內(nèi)微量注射AT1R阻斷劑氯沙坦 (50 nmol)，對Sham大鼠血壓沒有影響，但可使CIH大鼠血壓降低，并抑制Ang Ⅱ升壓作用。結(jié)論 室旁核中Ang Ⅱ及AT1R功能上調(diào)在慢性間歇性低氧誘發(fā)大鼠高血壓中起重要作用。

室旁核；血管緊張素II；慢性間歇性低氧；尾動脈收縮壓；高血壓；血管緊張素Ⅱ 1型受體

睡眠呼吸暫停綜合征(sleep apnea syndrome, SAS)與高血壓的關(guān)系甚為密切，慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是SAS的主要病理生理學特點和損傷機制，被認為是引起高血壓最為重要的因素[1]。為了研究間歇性低氧與高血壓的關(guān)系，F(xiàn)letcher等[2]首先建立了CIH實驗模型模擬SAS患者缺氧模式，從整體和系統(tǒng)水平證實了CIH的確可誘發(fā)大鼠高血壓。交感神經(jīng)系統(tǒng)活動過度增強是各種高血壓病的重要特征之一，在高血壓病的發(fā)生、發(fā)展中起了極其重要的作用，CIH引起高血壓的發(fā)病機制可能與持續(xù)增強的交感神經(jīng)活動有關(guān)[3]。下丘腦室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是整合心血管活動的重要核團，其下行纖維投射到延髓腹側(cè)面頭端和脊髓中間外側(cè)柱，進而控制交感節(jié)前神經(jīng)元和心血管活動[4]。最近研究表明，PVN與CIH條件下持續(xù)增強的交感神經(jīng)活動密切相關(guān)[5-6]。腦內(nèi)血管緊張素II(Ang Ⅱ)是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活動和動脈血壓重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與各種高血壓的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。本研究旨在探討PVN中Ang Ⅱ在CIH高血壓大鼠中的作用及機制，為臨床研發(fā)預防和治療高血壓疾病的新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物健康成年♂SD 大鼠，體質(zhì)量 180～200 g，SPF級，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食，室溫18～25 ℃。

1.2 儀器與試劑PowerLab 8/30 數(shù)據(jù)采集分析處理系統(tǒng)及橋式放大器(澳大利亞ADInstrument公司)；68003型單臂數(shù)字式立體定位儀及Strong 90式顱骨鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；XSD-100體式顯微鏡(蚌埠光學儀器廠)；微量進樣針 (上海安亭微量進樣器廠)；CYS-1型數(shù)字式測氧儀(南京新飛分析儀器制造有限公司)；無創(chuàng)血壓測定分析系統(tǒng)(ALC-NIBP，上海奧科特公司)。醫(yī)用壓縮氧氣(濃度 >99.9%) 、壓縮氮氣(濃度>99.99%)由合肥市醫(yī)用氧氣廠充裝。Ang Ⅱ、氯沙坦(losartan，LOS)購自Sigma公司。兔抗Ang Ⅱ抗體購自武漢博士德公司)；兔抗AT1R抗體、兔抗GAPDH抗體購自Santa Cruz公司。

1.3 間歇性低氧模型的制作實驗動物在適應性飼養(yǎng) 1周后進行實驗，隨機分成Sham組和CIH組，Sham組除不充入氮氣和氧氣外，其余均與CIH組做相同處理。通過氮氣稀釋原理，參照我們先前的方法，CIH 組大鼠放入間歇性低氧艙內(nèi)，向低氧艙循環(huán)充入氮氣和氧氣，每一循環(huán)為9 min，即 4 min 充入氮氣，隨之 5 min 充入氧氣，由測氧儀監(jiān)測間歇性低氧艙中的氧濃度，調(diào)節(jié)氣體流量，低氧艙內(nèi)氧濃度控制在6%～21%，使每一循環(huán)間歇性低氧艙內(nèi)的最低氧濃度達到 6% 左右，持續(xù)時間為 40 s 左右，然后再逐漸恢復至 21%。間歇性低氧艙內(nèi)氮氣和氧氣的轉(zhuǎn)換通過定時電磁轉(zhuǎn)換器來完成。該循環(huán)每天重復8 h(9 ∶00 am～5 ∶00 pm)，共15 d。

1.4 動脈血壓的測定在大鼠清醒狀態(tài)下，使用無創(chuàng)套尾法動態(tài)測量CIH過程中大鼠的尾動脈收縮壓(SBP)。在CIH 15d 后，進行急性動物實驗時，用動脈插管方法直接測量動脈血壓和心率。具體的方法是：腹腔注射烏來糖(600 mg·kg-1)+氯醛糖(30 mg·kg-1)的混合麻醉劑。依次進行氣管插管，左頸外靜脈和左頸總動脈插管術(shù)。左頸外靜脈與注入生理鹽水溶液的PE50聚乙烯管相接，左頸總動脈與充有肝素鈉生理鹽水溶液的PE50聚乙烯管相接，通過壓力換能器與PowerLab 8/30數(shù)據(jù)采集分析處理系統(tǒng)實時記錄大鼠的動脈血壓(ABP)、平均動脈壓(MAP)及心率(HR)。

1.5 Western blot檢測PVN 中Ang Ⅱ和AT1R大鼠深度麻醉后斷頭取腦，迅速在冰盤上剝?nèi)ワB骨，立即置于液氮中冷凍，并保存在-80℃低溫冰箱中。用冰凍切片機作大腦冠狀切片，根據(jù)Paxinos 和 Watson大鼠腦立體定位圖譜確定PVN位置，用15號針頭(內(nèi)徑1.5 mm)在PVN平面用打孔法取出PVN組織。取適量的RIPA裂解液與PVN組織在研缽器中研磨，裂解液的成分為：150 mol·L-1NaCl、50 mol·L-1Tris base、50 mol·L-1NaF、1% NP-40、1% PMSF，勻漿成為均一體系后放在離心機中離心(4℃，3 000 r·min-1，20 min)，取上清。采用SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進行反應，ECL顯色曝光。一抗分別為：兔抗Ang Ⅱ(1 ∶300)、兔抗AT1R(1 ∶200)、兔抗GAPDH(1 ∶600)，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(1 ∶8 000)。使用ImageJ軟件分析各蛋白條帶的光密度值，通過與內(nèi)參GAPDH的比值，分析Ang Ⅱ和AT1R蛋白相對水平。

1.6 PVN 中微量注射藥物將大鼠頭部固定于立體定位儀上，暴露前囟，根據(jù)Paxinos和Watson的大鼠立體定位圖譜，行雙側(cè)PVN插管(AP:-1.8 mm，RL: 0.4 mm，H: 7.9 mm)，插管外徑0.6 mm, 內(nèi)徑0.3 mm。雙側(cè)PVN微量注射藥液體積均為50 nL，于1 min內(nèi)注射完畢。實驗結(jié)束時雙側(cè)PVN分別注射50 nL的0.25%伊文思藍溶液，過量麻醉處死大鼠，取腦，將其放入10%的福爾馬林溶液中固定1周后，腦組織切片鑒定注射位點。注射位點不在PVN范圍內(nèi)的實驗數(shù)據(jù)不予統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果

2.1 慢性間歇性低氧對大鼠血壓的影響從間歇性低氧5 d開始CIH組尾動脈壓SBP比間歇性低氧前明顯升高，隨著間歇性低氧時間的延長，尾動脈壓SBP(r=0.808，P<0.01) 逐漸升高；Sham組尾動脈壓SBP無明顯變化(r=0.122，P>0.05)。與Sham組相比，間歇性低氧15 d后，CIH組尾動脈壓SBP[(18.7±0.2)vs(22.3±0.3)kPa，P<0.01]明顯升高(Fig 1)。

Fig 1 Changes on SBP of tail artery in sham and CIH rats(n=6)

*P<0.05，**P<0.01vsbefore CIH；##P<0.01vssham rat.

2.2 慢性間歇性低氧對大鼠PVN中Ang Ⅱ水平、AT1R蛋白表達的影響Western blot檢測顯示，與Sham組相比，CIH組大鼠PVN中Ang Ⅱ水平[(0.15±0.01)vs(0.63±0.13)，P<0.05，F(xiàn)ig 2A]和AT1R蛋白表達[(0.75±0.14)vs(1.99±0.45)，P<0.05， Fig 2B ]明顯升高。

2.3 PVN內(nèi)微量注射Ang Ⅱ?qū)Υ笫驧AP 的影響雙側(cè)PVN內(nèi)微量注射生理鹽水(NS)和三種劑量的Ang Ⅱ(0.03、0.3和3 nmol)，均可劑量依賴性地升高Sham和CIH大鼠MAP[Sham組ΔMAP：(0.02±0.1)、(0.2±0.09)、(1.13±0.1)、(2.24±0.15) kPa，r=0.874,P<0.05]；[CIH組ΔMAP：(0.04±0.04)、(0.71±0.13)、(1.73±0.1)、(3.44±0.22)kPa，r=0.904,P<0.05]，且CIH大鼠MAP升高較Sham大鼠更明顯(F=7.35，d.f.=40，P<0.05)(Fig 3)。不同劑量的Ang Ⅱ?qū)π穆蕸]有明顯影響，且無統(tǒng)計學意義。

Fig 2 Western blot analysis of PVN Ang Ⅱ level and AT1 receptor protein expression in sham and CIH rats(n=6)

*P<0.05vssham rats

2.4 PVN內(nèi)微量注射LOS對大鼠MAP的影響雙側(cè)PVN內(nèi)微量注射AT1R阻斷劑LOS (50 nmol)，對Sham大鼠血壓沒有影響[NS組vsLOS組：(0.02±0.1)vs(-0.18±0.06 ) kPa，P>0.05]，但可使CIH大鼠血壓降低[NS組vsLOS組：(0.04±0.04)vs(-1.02±0.14) kPa，P<0.01]，并可抑制Ang Ⅱ引起的升壓作用[Ang Ⅱ (0.3nmol)vsLOS +Ang Ⅱ (0.3 nmol)，Sham大鼠：(1.13±0.1)vs(0.11±0.06) kPa，P<0.01；CIH大鼠：(1.73±0.1)vs(0.49±0.1)kPa，P<0.01] (Fig 4)。

Fig 3 Effects of microinjection of Ang Ⅱ into PVN on MAP in sham rats and CIH rats(n=6)

A: Representative recordings showing the effects of PVN on the MAP responses to the Ang Ⅱ (3 nmol) in sham and CIH rats;B: Effects of microinjection of NS and three doses of Ang Ⅱ (0.03, 0.3 and 3 nmol) into the PVN on the MAP in sham and CIH rats.*P<0.05vsSham rats；#P<0.05 for significance of linear trend effect of Ang Ⅱ.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)間歇性低氧15 d后，大鼠PVN內(nèi)Ang Ⅱ水平及AT1受體表達明顯增加；PVN內(nèi)微量注射Ang Ⅱ，可劑量依賴性地升高Sham和CIH大鼠MAP，且CIH大鼠MAP升高更明顯；PVN內(nèi)微量注射AT1R阻斷劑氯沙坦，對Sham大鼠血壓沒有影響，但可使CIH大鼠血壓降低，并抑制Ang Ⅱ升壓作用。本研究結(jié)果提示PVN中Ang Ⅱ及AT1受體功能上調(diào)在CIH誘發(fā)大鼠高血壓中起重要作用。

睡眠呼吸暫停的缺氧模式為間歇性低氧，其特點是正常氧和低氧交替出現(xiàn)，呼吸暫停發(fā)生時血氧降到非常低的水平，而呼吸暫停恢復后又可以回到正常水平。低氧發(fā)生頻率很高、低氧程度嚴重、血氧變化幅度大，最低動脈血氧飽和度可降至 20%或更低，正常氧與低氧間動脈血氧飽和度之差可達 30%～70%。如此大幅度的缺氧和再氧合過程對機體的影響和危害是嚴重的，其程度遠大于持續(xù)低氧模式。這種間歇低氧的特點是睡眠呼吸暫停綜合征所特有，而其他任何低氧性疾病不具備。本實驗應用 CIH 大鼠模型模擬 SAS，采用的間歇性低氧模式為9 min 發(fā)生1次低氧，環(huán)境最低氧濃度降為6% 左右，1次低氧持續(xù)的時間約40 s，每天 8 h，連續(xù)低氧 15 d后，可引起大鼠血壓升高和交感神經(jīng)活動增強[8]。

Fig 4 Effects of microinjection of losartan into PVN on MAP in sham rats and CIH rats (n=6)

A: Representative recordings showing the effects of PVN pretreatment with losartan(50 nmol) on the MAP responses to the Ang Ⅱ(0.3 nmol) in CIH rats; B: Effects of microinjection of NS, Ang Ⅱ(0.3 nmol), losartan(50nmol)into the PVN on the MAP in sham and CIH rats.**P< 0.01vsNS；△△P<0.01vsAng Ⅱ；##P<0.01vsSham rats. The pretreatment with losartan was 5 min before Ang Ⅱ.

間歇性低氧引起高血壓的具體機制還不是十分清楚，但交感神經(jīng)系統(tǒng)激活在其中起著重要作用[9]。交感神經(jīng)活動過度增強是各種高血壓的重要特征之一，在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的作用。Fletcher等[2]運用頸動脈體去神經(jīng)支配、切斷支配腎上腺的交感神經(jīng)或去除腎上腺髓質(zhì)等阻斷交感神經(jīng)系統(tǒng)的方法，可抑制CIH引起的血壓升高。CIH時，反復刺激頸動脈體化學感受器，使其敏感性增加，從而誘導交感神經(jīng)活動的過度增強。PVN 是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活動和動脈血壓的重要中樞結(jié)構(gòu)之一，通過與化學感受性反射中樞(孤束核和延髓腹側(cè)面頭端)的纖維聯(lián)系對化學感受性反射進行調(diào)節(jié)。Olivan等[10]發(fā)現(xiàn)，在清醒的大鼠，電損毀雙側(cè)PVN后，靜脈注射氰化鉀(KCN)激活化學感受性反射產(chǎn)生的升壓反應的幅度和持續(xù)時間被明顯地抑制；形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，低O2或高CO2刺激激活化學感受性反射，大鼠PVN內(nèi)c-Fos陽性神經(jīng)元數(shù)目增多，提示PVN涉及化學感受性反射的調(diào)節(jié)[11]。

PVN內(nèi)神經(jīng)元的活動受抑制性(GABA受體介導)或興奮性(興奮性氨基酸受體和AT1受體介導)緊張性傳入的雙重調(diào)控。在正常情況下，交感興奮和交感抑制保持相對平衡，而在某些疾病狀態(tài)下這種平衡被打破，引起交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活[12-14]。Sharpe等[5]發(fā)現(xiàn)，與正常對照組大鼠相比，PVN內(nèi)注射GABAA受體激動劑蠅覃醇，引起CIH大鼠血壓和交感神經(jīng)活動下降更為明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧15 d后，大鼠PVN內(nèi)Ang Ⅱ水平及AT1受體表達明顯增加；PVN內(nèi)微量注射AT1R阻斷劑氯沙坦，可降低CIH大鼠血壓，而對Sham大鼠沒有影響，提示PVN中Ang Ⅱ作為一種興奮性遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，通過AT1受體介導了CIH誘發(fā)的高血壓。Da等[15]也發(fā)現(xiàn)，長期灌注GABAA受體激動劑蠅覃醇或Ang Ⅱ受體阻斷劑，抑制PVN內(nèi)神經(jīng)元活動，可逆轉(zhuǎn)間歇性低氧大鼠的血壓升高。

總之，我們及其他學者的研究表明，PVN中Ang Ⅱ在間歇性低氧誘發(fā)的高血壓中起著極其重要的作用，PVN中Ang Ⅱ可能成為治療CIH誘發(fā)高血壓的一個潛在靶標。臨床上，AT1受體拮抗劑如氯沙坦、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑如卡托普利是治療高血壓等心血管疾病的一線藥，傳統(tǒng)的觀點認為它們的作用主要是降低心肌的后負荷、減少血容量以及改變血管和心肌的重塑等，但新的觀點認為它們還作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)如PVN等核團的神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)發(fā)揮調(diào)節(jié)心血管活動作用。

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AngⅡin paraventricular nucleus contribute to chronic intermittent hypoxia induced-hypertension in rats

YU Xiao-hai,LI Yan,DING Yang, TANG Zhi-qiang,WANG Jin-li,FAN Yi-fei,CHENG Wen-hui,ZHONG Ming-kui

(DeptofPhysiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Aim To determine whether AngⅡin paraventricular nucleus (PVN) was involved in the chronic intermittent hypoxia (CIH) induced-hypertension in rats. Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into Sham and CIH groups,the Sham rats were exposed to continuous normoxia, while the CIH rats were submitted to CIH(8 h per day for 15 days). The conscious noninvasive method with tail cuff was performed in rats to record the systolic blood pressure during establishing the model of CIH induced hypertension. Mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) were recordedinvivoon a PowerLab data acquisition system after CIH. Rats were fixed on the stereotaxic instrument to conduct microinjection in the PVN.We used Western blot to measure Ang Ⅱ level and Ang Ⅱ type 1 receptor (AT1R) protein expression in PVN. Results The level of PVN Ang Ⅱin CIH rats was significantly higher than that in Sham rats, along with increased AT1R protein expression. Microinjection of Ang Ⅱ(0.03,0.3,3 nmol)in bilateral PVN dose-dependently increased MAP in both CIH and Sham rats, and this response was significantly augmented in CIH rats. Losartan (50 nmol), AT1R antagonist, had no effect on MAP in Sham rats，but caused significant MAP decreases in CIH rats, and prevented Ang Ⅱ-induced increases in MAP in both CIH and Sham rats. Conclusion The results suggest that the increased Ang Ⅱrelease and enhanced AT1R activation in the PVN contribute to CIH induced-hypertension in rats.

paraventricular nucleus; angiotensin Ⅱ; chronic intermittent hypoxia; systolic blood pressure; hypertension; Ang Ⅱ type 1 receptor

時間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.028.html

2015-01-14,

2015-02-24

國家自然科學基金資助項目(No 81070066)；安徽省教育廳自然科學重點項目(No KJ2010A176)；安徽醫(yī)科大學博士科研基金(No XJ200823)

余孝海(1988-)，男，碩士生，研究方向：心血管生理，E-mail:812048130@qq.com; 鐘明奎(1968-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心血管生理，通訊作者，E-mail：zhongmkcn@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.024

A

1001-1978(2015)05-0716-05

R-332；R341.6；R544.1；R845.22；R977.6