王天曉，魏曉利，李登云

(河南大學(xué)中藥研究所, 河南大學(xué)藥學(xué)院, 河南 開封 475004)

FFJ-5下調(diào)PKM2抑制MCF7生長及逆轉(zhuǎn)MCF7/DOX細胞耐藥性的研究

王天曉，魏曉利，李登云

(河南大學(xué)中藥研究所, 河南大學(xué)藥學(xué)院, 河南 開封 475004)

目的 探討 FFJ-5 對人乳腺癌細胞 MCF7 及其耐藥細胞 MCF7/DOX 的作用及其機制。方法 采用 MTT 法檢測 FFJ-5 對 MCF7 及 MCF7/DOX 細胞的增殖抑制作用及其對柔紅霉素(doxorubicin, DOX)在耐藥細胞MCF7/DOX中化療敏感性的影響；Western blot 檢測 FFJ-5 對EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PKM2、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP及P-gp蛋白表達的影響；DNA ladder 分析檢測FFJ-5對細胞基因組DNA的影響； RT-PCR檢測低劑量 FFJ-5 對多藥耐藥基因MDR1 mRNA 水平的影響。結(jié)果 FFJ-5抑制了MCF7 細胞生長，降低了MCF7 細胞中EGFR、Akt 的表達及活性，下調(diào)了PKM2 水平；FFJ-5 可激活caspase-3、促使基因組DNA斷裂；同時FFJ-5也能抑制耐藥細胞MCF7/DOX 生長，并增強 DOX 在MCF7/DOX細胞中的活性，同時降低了MCF7/DOX細胞中EGFR、p-EGFR 及PKM2水平，但對MDR1 mRNA水平無影響。 結(jié)論 FFJ-5 可通過抑制 EGFR-Akt-PKM2 通路及激活線粒體凋亡相關(guān)因子 caspase-3 來抑制MCF7細胞生長，并誘導(dǎo)其凋亡，并可逆轉(zhuǎn)MCF7/DOX的耐藥性。

FFJ-5；丙酮酸激酶M2；EGFR；Akt；細胞凋亡；細胞耐藥性；信號通路

乳腺癌是女性多發(fā)惡性腫瘤之一，手術(shù)、放療及化療仍是目前常采用的治療方法，然而，化療耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重阻礙了乳腺癌的有效治療。因此，尋找新的化療藥物及治療靶點或加以輔助手段減少傳統(tǒng)化療藥物的用量并提高其療效具有重要意義。腫瘤細胞與正常細胞代謝上的區(qū)別在于即使在供氧充足的條件下，腫瘤細胞的糖酵解產(chǎn)物也很少經(jīng)過氧化磷酸化過程，腫瘤細胞主要依靠糖酵解的中間產(chǎn)物來合成生物大分子并提供能量，而丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2，PKM2) 則觸發(fā)了腫瘤細胞有氧酵解的這一代謝過程[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在多種腫瘤細胞中過表達，還可激活兩個糖酵解基因GLUT1和LDHA，從而促進葡萄糖的消耗以及乳酸的生成，增加了腫瘤的酸性微環(huán)境，促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，使得腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，逃避化療藥物[3]。下調(diào)PKM2的表達及活性可抑制腫瘤細胞的生長[4]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)過表達與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵潤、預(yù)后差有關(guān)，PI3K/Akt通路是EGFR下游的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。有研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細胞中抑制Akt的磷酸化可使PKM2水平降低[5]。因此，EGFR/Akt通路可能與PKM2的表達有關(guān)。FFJ-5為抗癌中藥茜草提取物的結(jié)構(gòu)修飾物，本研究擬以乳腺癌MCF7及其耐藥細胞MCF7/DOX為實驗對象，研究FFJ-5對EGFR/Akt/PKM2表達的影響，探討FFJ-5的抗腫瘤活性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑RPMI 1640培養(yǎng)基及新生牛血清購于Invitrogen公司； MTT購于Sigma公司； RT-PCR試劑盒為北京全式金生物公司產(chǎn)品； EGFR(18986-1AP)、p-EGFR(Tyr1068)(1H12)、Akt(11E7)、p-Akt(Ser473)(D9E)、PKM2(D78A4)、caspase-3(8G10)、cleaved caspase-3(Asp175)(5A1E)、PARP(46D11)、cleaved PARP(Asp214)(D64E10)一抗為Cell Sgnaling Technology 公司產(chǎn)品； P-gp(TC3.A.1.201)、β-actin(66009-1-lg)一抗及HRP標(biāo)記二抗購于Protein Technology；Hoechst 33342及DNA ladder抽提試劑盒為碧云天產(chǎn)品；多柔比星(doxorubicin, DOX)為浙江海正藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；FFJ-5為茜草提取物的結(jié)構(gòu)修飾物，由河南大學(xué)藥學(xué)院康文藝?yán)蠋燄佡洝?/p>

1.2 細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞MCF7及其耐藥細胞MCF7/DOX購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，用含10 %血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。MCF7/DOX細胞用終濃度為1.84 μmol·L-1DOX維持其耐藥性，實驗前2周換用無DOX的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細胞增殖檢測采用MTT方法。FFJ-5的終濃度分別為0、6.75、13.5、27、54、108 μmol·L-1。DOX的使用終濃度分別為0、0.46、0.92、1.84、3.68、7.36 μmol·L-1(在MCF7細胞中)和0、9.2、18.4、36.8、73.6 μmol·L-1(在MCF7/DOX細胞中)。作用48 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光值(A值)，計算細胞抑制率。

1.4 DNA ladder 分析收集經(jīng)不同濃度FFJ-5處理48 h 的MCF7 及MCF7/DOX 細胞，用DNA ladder 抽提試劑盒(碧云天產(chǎn)品)提取基因組DNA，然后經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析以檢測細胞凋亡。胰酶消化后，PBS或生理鹽水洗1次，1 000～2 000×g離心1～2 min，棄上清，收集細胞。胰酶消化后，PBS或生理鹽水洗1次，1 000～2 000×g離心1～2 min，棄上清，收集細胞。

1.5 Western blot收集經(jīng)FFJ-5處理48 h后的MCF7及MCF7/DOX細胞，加入RIPA細胞裂解液, 冰上裂解30 min 后, 超聲勻漿提取細胞總蛋白并定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE 膠電泳分離后, 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上, 室溫下5% 脫脂牛奶封閉l h, 加入EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、PKM2、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP及P-gp一抗4 ℃過夜, 洗膜3 次后, 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h, 再洗膜3 次, 經(jīng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Alpha, USA)檢測蛋白表達水平。β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.6 RT-PCR經(jīng)0、13.5、27 μmol·L-1FFJ-5處理48 h后的MCF7/DOX細胞，應(yīng)用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，利用RT-PCR試劑盒擴增MDR1 mRNA。MDR1-Forward primer: 5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′, Reverse primer ：5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′ ，Product length:157 bp。GAPDH為內(nèi)參,Forward primer 5′-CAAGGTCATCCATGACAA CTTTG-3′，Reverse primer 5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′ ，Product length: 496 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 FFJ-5抑制MCF7及MCF7/DOX細胞生長MTT結(jié)果顯示，F(xiàn)FJ-5作用48 h后，其對MCF7細胞的IC50為65.79 μmol·L-1，其在MCF7/DOX細胞中的IC50為66.66 μmol·L-1，MCF7及MCF7/DOX細胞的生長受到明顯抑制，并呈劑量依賴性 (Fig 1)。

2.2 FFJ-5抑制MCF7細胞EGFR-Akt-PKM2通路Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)FJ-5可劑量依賴性抑制MCF7中PKM2的表達(Fig 2A)。而膜受體酪氨酸激酶(RTKs)-PI3K/Akt- mTOR信號通路在控制細胞的生長、增殖、存活、營養(yǎng)和能量代謝等生命過程中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通過上調(diào)PKM2促進腫瘤細胞有氧糖酵解。因此本研究檢測了FFJ-5對EGFR-Akt-PKM2通路的影響，發(fā)現(xiàn)FFJ-5可抑制MCF7細胞中EGFR-Akt的表達和活性(Fig 2B)?？梢奆FJ-5可能通過抑制EGFR-Akt-PKM2通路來抑制MCF7細胞生長。

2.3 FFJ-5激活caspase-3并引起MCF7細胞基因組DNA斷裂在細胞內(nèi)凋亡途徑中，誘發(fā)線粒體釋放細胞色素C，級聯(lián)激活caspase-3，降解底物可促使細胞凋亡。聚ADP核糖多聚酶(PARP)為caspase-3的作用底物，是一種DNA修復(fù)相關(guān)分子，被酶解失活后細胞的功能和形態(tài)發(fā)生變化，表現(xiàn)為細胞固縮，與鄰近細胞分離，同時染色質(zhì)聚集，核碎裂，最后細胞分裂為凋亡小體。本研究顯示，F(xiàn)FJ-5可激活caspase-3，促進PARP裂解(Fig 3A)。DNA ladder 分析結(jié)果顯示，F(xiàn)FJ-5可引起MCF7細胞基因組DNA發(fā)生斷裂 (Fig 3B)。

Fig 2 Effect of FFJ-5 on expression of EGFR-Akt-PKM2 pathway in MCF7 cells

Western blot was used to detect the levels of PKM2(A), EGFR, p-EGFR, Akt, p-Akt (B) protein. Results showed that FFJ-5 inhibited the pathway of EGFR-Akt-PKM2.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 FFJ-5 activated caspase-3 and induced genomic DNA fragmentation

A: The effect of FFJ-5 on caspase-3 and PARP in MCF7 cells. Western blot was used to detect the levels of caspase-3, cleaved caspase-3, PARP and cleaved PARP. Results showed that FFJ-5 could activate caspase-3 and consequently promote the cleavage of PARP; B: DNA fragmentation analysis. Genomic DNA was extracted from cells exposed to FFJ-5 for 48 h, then DNA ladder analysis was performed. Results showed that FFJ-5 could induce the change of cell apoptotic morphology and DNA fragmentation in MCF7.

2.4 FFJ-5在柔紅霉素耐藥的MCF7/DOX細胞中的作用我們首先對MCF7/DOX的耐藥特征進行鑒定，以阿霉素作為化療藥物，其耐藥倍數(shù)為27.90(Fig 4A)，而且MCF7/DOX細胞有多藥耐藥蛋白P-gp的高表達(Fig 4B)，表明MCF7/DOX細胞具有耐藥表型及耐藥特征。由此，我們以MCF7/DOX細胞為實驗對象，研究FFJ-5在耐藥細胞中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5對MCF7/DOX細胞的生長抑制率小于20%(Fig 4C)，分別以13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5與DOX 合用后，可使DOX在MCF7/DOX細胞中的IC50分別降低21.21%和42.19%，增強了DOX在MCF7/DOX中的敏感性(Fig 4D)。同時我們也檢測了13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5 對MCF7/DOX 細胞中MDR1 mRNA水平的影響，結(jié)果顯示,13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5 不會影響MDR1 mRNA的表達(Fig 4E)。但13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5可抑制EGFR的表達及活性，并降低了MCF7/DOX細胞中PKM2的水平(Fig 4F)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)FJ-5可能不是通過影響MDR1基因表達的方式來增強DOX的敏感性，可能通過其它途徑比如抑制EGFR-PKM2通路來逆轉(zhuǎn)MCF7/DOX細胞耐藥性。

Fig 4 Roles of FFJ-5 in MCF7/DOX cells

A: IC50of DOX in MCF7 and MCF7/DOX cells; B: The expression of P-gp in MCF7 and MCF7/DOX cells; C: FFJ-5 inhibited the growth of MCF7/DOX cells; D: FFJ-5 increased the activity of DOX in MCF7/DOX cells. All data were expressed as mean±standard deviation (SD); E: The effect of FFJ-5 on MDR1 mRNA in MCF7/DOX. RT-PCR assay was used to detect the mRNA level; F: The effect of FFJ-5 on expression of EGFR and PKM2 in MCF7/DOX cells.

3 討論

中藥茜草為茜草科植物茜草的根及根莖，具有涼血、化瘀、止血之功效?，F(xiàn)有研究顯示中藥茜草提取物具有抗腫瘤活性[6-7]。FFJ-5是中藥茜草提取物的結(jié)構(gòu)修飾物，本研究顯示FFJ-5可明顯抑制人乳腺癌MCF7細胞的生長，并可誘導(dǎo)其凋亡。

腫瘤細胞的有氧糖酵解對腫瘤細胞的增殖和凋亡具有重要意義。與線粒體的氧化磷酸化相比，糖酵解可以更加迅速地產(chǎn)生能量，而且糖酵解的許多中間產(chǎn)物可被腫瘤細胞利用合成蛋白質(zhì)、核酸及脂類，從而滿足腫瘤迅速生長的需要[8-10]。Gatenby和Gillies[11-12]提出，在有氧條件下持續(xù)地將葡萄糖向乳酸轉(zhuǎn)化是腫瘤在形成早期對間歇性缺氧的一種適應(yīng)性行為，這種轉(zhuǎn)化使細胞周圍環(huán)境酸化，增加了細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移力，使細胞對放射療法和化學(xué)療法產(chǎn)生抵抗效應(yīng)，從而也促進了腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生。因此，抑制腫瘤細胞的糖酵解過程則會抑制其生長、促進其凋亡。腫瘤細胞的糖酵解過程受多個酶的調(diào)節(jié)，這為腫瘤治療提供了很多潛在的靶點。

PKM2作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，在腫瘤細胞中高表達，觸發(fā)了腫瘤細胞有氧酵解的代謝過程，從而為腫瘤細胞的生長提供物質(zhì)及能量的需求，促進腫瘤細胞的增殖。PKM2現(xiàn)已成為腫瘤治療的有效靶點，以PKM2為靶點，篩選PKM2抑制劑，對腫瘤治療及抗腫瘤新藥研發(fā)具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)FJ-5可下調(diào)PKM2表達，而且可能通過抑制EGFR通路來調(diào)控PKM2的表達，從而抑制乳腺癌MCF7細胞的生長。也有研究顯示，PKM2與線粒體的細胞凋亡密切相關(guān)[13]。本研究顯示，F(xiàn)FJ-5可激活caspase-3，促進PARP裂解，并引起基因組DNA斷裂，從而誘導(dǎo)MCF7 細胞發(fā)生凋亡。

本研究也探討了FFJ-5在耐藥細胞MCF7/DOX中的作用，及其對DOX在MCF7/DOX細胞中作用的影響。結(jié)果顯示FFJ-5也可抑制耐藥細胞MCF7/DOX的生長，且13.5 μmol·L-1和27 μmol·L-1FFJ-5降低了DOX對MCF7/DOX細胞的IC50，增強了DOX在MCF7/DOX細胞的敏感性。同時對其增強DOX化療敏感性的機制進行初步探討，發(fā)現(xiàn)FFJ-5不會影響MCF7/DOX細胞中MDR1 mRNA的表達，其可能通過其它途徑比如EGFR-PKM2通路來增強DOX的敏感性，還有待進一步研究。

綜上，F(xiàn)FJ-5可通過EGFR通路下調(diào)PKM2表達，抑制人乳腺癌MCF7細胞生長，并可誘導(dǎo)其凋亡。同時FFJ-5還可增強DOX在耐藥腫瘤細胞中的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。PKM2可能成為腫瘤治療的有效靶點，F(xiàn)FJ-5有望發(fā)展成為一種有效的抗腫瘤候選藥物。

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FFJ-5 inhibits growth of MCF7 cells and reverses drug resistance of MCF7/DOX cells via down-regulation of PKM2

WANG Tian-xiao,WEI Xiao-li,LI Deng-yun

(InstituteofChineseMateriaMedica,HenanUniversity,PharmaceuticalCollegeofHenanUniversity,KaifengHenan475004,China)

Aim To investigate the roles of FFJ-5 in human breast cancer MCF7 cells and drug-resistant MCF7/DOX cells and to explore its mechanisms. Methods MTT assay was used to detect the effect of FFJ-5 on MCF7 and MCF7/DOX cell proliferation and sensitivity of doxorubicin in MCF7/DOX cells. Western blot was used to investigate the effect of FFJ-5 on expression of EGFR, p-EGFR, Akt, p-Akt, PKM2, cleaved caspase-3, cleaved PARP and P-gp. DNA ladder analysis was performed to determine the effect of FFJ-5 on genomic DNA. RT-PCR was performed to detect the influence of FFJ-5 on multidrug resistance gene MDR1 mRNA levels. Results The results showed that FFJ-5 inhibited the growth of MCF7, inhibited the expression and activity of EGFR and Akt, and consequently reduced the expression of PKM2 in MCF7 cells; FFJ-5 activated caspase-3 and induced genomic DNA fragmentation; FFJ-5 also inhibited the growth of MCF7/DOX cells and enhanced the anti-tumor activity of doxorubicin in MCF7/DOX cells. Conclusion The results suggest that FFJ-5 could inhibit MCF7 cell growth and induce MCF7 cell apoptosis through inhibition of EGFR-Akt-PKM2 pathway and activation of apoptosis-related factors caspase-3, meanwhile FFJ-5 could also reverse the resistance of MCF7/DOX.

FFJ-5; PKM2; EGFR; Akt；cell apoptosis；drug resistant cells; cell signal pathway

時間：2015-4-15 15:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.024.html

2015-01-17,

2015-02-22

河南省科技廳重點攻關(guān)項目(No 122102310558)；河南省教育廳自然科學(xué)研究項目 (No 2011A310001)

王天曉(1975-)，女，博士，副教授，研究方向：抗腫瘤藥物篩選及機制研究,通訊作者，Tel/Fax：0371-23880680，E-mail：wtx1975@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.025

A

1001-1978(2015)05-0721-06

R329.24；R329.25；R345.57；R737.902.2；R979.1