羅剛銀，王弼陡，繆 鵬，王 磊，王鐘周，錢 慶，錢 俊

(中國科學院 蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所，中科院生物醫(yī)學檢驗技術重點實驗室，中國 江蘇215163)

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激光共聚焦近紅外熒光掃描系統(tǒng)光學設計

羅剛銀，王弼陡，繆 鵬，王 磊，王鐘周，錢 慶，錢 俊

(中國科學院 蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所，中科院生物醫(yī)學檢驗技術重點實驗室，中國 江蘇215163)

為了實現(xiàn)對近紅外熒光的高分辨率掃描，設計了工作在近紅外光譜區(qū)的激光共聚焦光學系統(tǒng)。采用結構簡單的凹凸雙透鏡物鏡實現(xiàn)了照明光路和發(fā)射光路的設計，并采用Zemax軟件進行了光學設計和仿真。實驗表明：照明光路的聚焦彌散斑小于1 μm，照明針孔處的聚焦光斑小于40 μm，滿足照明針孔的尺寸要求；發(fā)射針孔處的聚焦光斑小于10 μm，滿足探測針孔尺寸要求；同時照明光路和發(fā)射光路的MTF曲線的截止頻率都分別滿足其衍射極限分辨率的要求，照明光路在全視場空間分辨率420 lp/mm處MTF>0.08，發(fā)射光路在全視場空間頻率400 lp/mm處MTF>0.07。

光學設計；近紅外熒光掃描；激光共聚焦；Zemax

引言

熒光標記技術是指利用一些能發(fā)射熒光的物質(如熒光探針，熒光染料等)共價結合或物理吸附在所要研究樣本的某個基團(如蛋白分子等)上，然后利用熒光掃描儀等儀器檢測其熒光特性來提供被研究對象的內(nèi)部結構信息(如抗原抗體分布、濃度等)。用于熒光標記的熒光物質有很多，而其中的近紅外熒光染料(near infrared fluorescence, NIR)具有獨特的優(yōu)點。近紅外熒光染料的發(fā)射波長為700 nm～1 200 nm，在該范圍內(nèi)生物分子自身熒光較弱，可避免背景干擾而獲得較高的分析靈敏度。近紅外熒光具有較強的穿透能力，能夠實現(xiàn)樣本的深層檢測，近紅外熒光對樣本造成的光損傷較低，也有利于實現(xiàn)活體檢測[1]。

激光誘導熒光技術(laser induced fluorescence， LIF)是常見的熒光檢測技術，而激光共聚焦掃描技術(confocal laser scanning, CLS)是共聚焦技術與LIF技術相結合的產(chǎn)物。LIF技術和CLS技術都采用激光作為發(fā)射熒光的激發(fā)光源，但是LIF技術中照明激光和發(fā)射熒光不通過同一物鏡，激光往往對樣本進行斜射照明，是場光源，可用于普通的熒光顯微鏡；而CLS技術中照明激光和發(fā)射熒光通過同一物鏡，激光往往對樣本進行垂直照明，是點光源[2]，可用于激光共聚焦顯微鏡。相對于LIF技術，CLS技術具有更高的分辨率[3]，并且可以實現(xiàn)深度熒光掃描。

本文根據(jù)CLS技術的工作原理，針對近紅外熒光染料的光譜需求，設計了近紅外熒光掃描光學系統(tǒng)，并采用Zemax軟件對光學設計進行了優(yōu)化。

1 激光共聚焦工作原理

CLS技術是利用照明針孔對照明光源的空間濾波和整形作用，形成點光源對樣品進行照射，而點光源具有發(fā)散小、能量集中等優(yōu)點，有利于對樣品中的熒光物質進行高效激發(fā)，這也避免了場光源照射時樣品中每一點的熒光激發(fā)都會受到鄰近點的衍射或散射光干擾的問題。同時，CLS技術還利用樣品中的點光源照射點與探測針孔的共軛關系來實現(xiàn)有用熒光的抗干擾、高精度探測，即只有在焦平面上的點光源照射點所發(fā)出的熒光能夠通過探測針孔被光電探測元件所接收，而焦平面以外的干擾熒光和散射光不能通過探測針孔?？梢?，CLS光學系統(tǒng)中的照明針孔和探測針孔共同聚焦于樣品中的點光源照明點，從而實現(xiàn)樣品中的激發(fā)熒光的高分辨率探測。

CLS光學系統(tǒng)主要由照明光源、照明光濾光片、照明光聚焦透鏡組、照明針孔、準直透鏡組、二向色鏡、物鏡、發(fā)射光濾光片、發(fā)射光聚焦透鏡組、探測針孔、光電探測元件等構成，如圖1所示。

圖1中，LASER為用作照明光源的激光器，F(xiàn)1為照明光濾光片，F(xiàn)2為發(fā)射光濾光片，L1為照明光聚焦透鏡組，L2為準直透鏡組，L3為物鏡，L4為發(fā)射光聚焦透鏡組，A1為照明針孔，A2為探測針孔，D1為用于照明光和發(fā)射光分離的二向色鏡，PMT為用于光電探測的光電倍增管。按照功能劃分，CLS光學系統(tǒng)包括照明光路和發(fā)射光路兩部分，其中照明光路包括的光學元件有LASER、F1、A1、L1、L2、L3、D1，而發(fā)射光路包括的光學元件有L3、L4、D1、F2、A2、PMT。

圖1 激光共聚焦工作原理圖Fig.1 Principle diagram of confocal laser scanning

2 光學系統(tǒng)的設計指標

CLS光學系統(tǒng)的照明光源是方向性、單色性很好的激光，采用平行入射的方式進入光學系統(tǒng)，因此在光學設計時只需校正軸上點，即0視場的球差。具體的設計任務要求如下：

1) 視場角w=0°，入瞳直徑為8 mm，只校正軸上點球差。

2) 工作于近紅外波段，其中照明激光光源的波長為780 nm，發(fā)射熒光的波長為820 nm。

3) CLS光學系統(tǒng)常用的照明針孔和探測針孔的尺寸范圍為50 μm ～300 μm，因此照明光聚焦透鏡組L1和發(fā)射光聚焦透鏡組L2的焦點彌散斑應該小于50 μm。

4) CLS光學系統(tǒng)的共聚焦焦點的幾何彌散斑直徑小于1 μm。

5) 鏡頭結構盡量簡單。

3 具體光學設計過程

3.1 物鏡(L3)光學設計

考慮到單透鏡很難校正球差，因此采用凹凸雙透鏡結構[4]來設計CLS系統(tǒng)的物鏡L3，設置入瞳直徑為8 mm，角度視場為0視場，波長為780 nm，F(xiàn)數(shù)=1/2?？紤]選擇一種類似于雙膠合透鏡的結構，先簡單將所有的半徑設置為20 mm，所有的厚度設置為6 mm，兩塊透鏡分別選擇高反射率的玻璃SF59(n=1.95)和ZF14(n=1.92)，如表1所示。初始結構的像差曲線、點列圖和MTF曲線分別如圖2、圖3和圖4所示，由以上圖示可見，該初始結構的像差很大，由MTF曲線也可看出該初始結構的成像質量很差，因此需要校正像差。

表1 物鏡初始結構參數(shù)

圖2 初始結構的像差曲線Fig.2 Ray fan of initial structure

圖3 初始結構的點列圖Fig.3 Spot diagram of initial structure

圖4 初始結構的MTF曲線Fig.4 MTF curves of initial structure

由于本物鏡只校正軸上點球差，因此通過設置優(yōu)化函數(shù)進行球差校正，從而得到所需的物鏡結構。優(yōu)化函數(shù)的具體設置如下：

1) 設置優(yōu)化函數(shù)為“RMS(均方根)+Spot Radius(像點尺寸)+Centroid(質心點)”。

2) 設置玻璃厚度邊界條件為“Min=1，Max=8”。

3) 設置空氣間隔邊界條件為“Min=1，Max=16”。

4) 增加LONA和SPHA優(yōu)化操作數(shù)，設置“Target=0，Weight=1”。

5) 將第1、2、3面鏡的r值設置為變量，通過選擇最后一面鏡的r值的Slove Type類型F Number值為1/2來限制物鏡的F數(shù)。

6) 將4個面鏡的d值都設置為變量。

首先采用“Optimization”進行自動優(yōu)化，然后選擇“Hammer Optimization”進一步錘形優(yōu)化[5]。優(yōu)化后的凹凸雙透鏡物鏡的結構參數(shù)如表2所示，其三維圖、像差曲線、點列圖分別如圖5、圖6和圖7所示。由圖5～圖7可見，設計的凹凸雙透鏡物鏡的像差很小，光學彌散斑的直徑小于1 μm。

表2 優(yōu)化后的物鏡結構參數(shù)

圖5 優(yōu)化后物鏡的三維圖與渲染圖Fig.5 3D layout and shaded model of optimized objective

圖6 優(yōu)化后物鏡的像差曲線Fig.6 Ray fan of optimized objective

圖7 優(yōu)化后物鏡的點列圖Fig.7 Spot diagram of optimized objective

物鏡的數(shù)值孔徑表征物鏡的聚光能力，是物鏡的重要性質之一，增強物鏡的聚光能力可提高物鏡的分辨率。數(shù)值孔徑NA的計算公式如下：

NA=n·sinθ

(1)

式中：n為物鏡與觀察對象之間介質的折射率；如空氣的折射率為1；θ為物鏡的孔徑半角，計算得該物鏡的數(shù)值孔徑值為0.24。

數(shù)值孔徑NA是顯微鏡物鏡最主要的光學特性，它決定了物鏡的衍射分辨率δ[6]的大小，其計算公式為

(2)

該物鏡的工作波長為780 nm，因此其衍射分辨率為1.98 μm。優(yōu)化后的物鏡的MTF曲線如圖8所示，可見其在全視場空間頻率N=1/δ=504 lp/mm處的MTF>0.1[7]，因此具有極高的分辨率。

圖8 優(yōu)化后物鏡的MTF曲線Fig.8 MTF curves of optimized objective

由于該物鏡只是照明光路和發(fā)射光路的一部分，還需要分別和照明光路、發(fā)射光路一起校正球差，因此該物鏡的參數(shù)結構在照明光路和發(fā)射光路的設計過程中還會繼續(xù)做調(diào)整。

1.2 照明光路(F1、A1、L1、L2、L3)設計

為了簡化光路，選擇單凸透鏡設計照明光聚焦透鏡組L1，玻璃材料依然選擇SF59。單凸透鏡結構參數(shù)如表3所示，其三維圖與渲染圖如圖9所示，點列圖如圖10所示。該照明光聚焦透鏡組L1的會聚光斑的點列圖小于40 μm，因此完全滿足目前激光共聚焦常用照明針孔直徑為50 μm～300 μm的實際應用需求。同時，由于所采用單凸透鏡的第2面鏡為平面，因此也進一步降低了該透鏡的加工和安裝要求。

表3 單凸透鏡結構參數(shù)

圖9 單凸透鏡的三維圖與渲染圖Fig.9 3D layout and shaded model of single convex lens

圖10 單凸透鏡的點列圖Fig.10 Spot diagram of single convex lens

同樣，采用單凸透鏡設計準直透鏡組L2，其初始結構與表3相同，并添加二向色鏡的反光面和物鏡L3，得到照明光路的初始結構。為進一步優(yōu)化該照明光路，保持照明光聚焦透鏡組L1的光學結構固定不變，設置準直透鏡組L2的凸面(第4面)和物鏡L3的4個面(第6、7、8、9面)的r值為變量，設置L2的玻璃厚度d值為變量，同時設置L3的玻璃厚度d值和空氣間隔d值為變量。先采用“Optimization”進行自動優(yōu)化，然后選擇“Hammer Optimization”進一步錘形優(yōu)化，通過改變r值、d值的方法來優(yōu)化照明光路結構，優(yōu)化后的照明光路結構參數(shù)如表4所示，其三維圖和渲染圖如圖11所示。

表4 優(yōu)化后的照明光路結構參數(shù)

圖11 照明光路的三維圖與渲染圖Fig.11 3D layout and shaded model of lighting lens

優(yōu)化后的照明光路的像差曲線、點列圖、MTF曲線分別如圖12、圖13和圖14所示。由圖12～圖14可見該照明光路的彌散斑尺寸小于1 μm。另外，物鏡L3的參數(shù)結構在照明光路像差校正的過程中已經(jīng)重新調(diào)整，其數(shù)值孔徑為0.2，工作波長為780 nm，由公式(2)計算可得照明光路的衍射分辨率為2.38 μm，因此由圖13可知，其在全視場空間頻率N=1/δ=420 lp/mm處的MTF>0.08[7]，因此該照明光路具有極高的點光源分辨率。

圖12 照明光路的像差曲線Fig.12 Ray fan of lighting lens

圖13 照明光路的點列圖Fig.13 Spot diagram of lighting lens

圖14 照明光路的MTF曲線Fig.14 MTF curve of lighting lens

1.3 發(fā)射光路設計

為了簡化光路，同樣選擇凹凸雙透鏡設計發(fā)射光聚焦透鏡組L4，其初始結構與物鏡L3相同，并添加物鏡L3和二向色鏡的折射面，選擇二向色鏡D1和發(fā)射光濾光片F(xiàn)2的玻璃材質為BK7，設置物方數(shù)值孔徑為0.2，得到其發(fā)射光路的初始結構。為進一步優(yōu)化該發(fā)射光路，設置發(fā)射光聚焦透鏡組L4的4個面(第9、10、11、12面)的r值為變量，設置L4的兩塊玻璃厚度d值和空氣間隔d值為變量，同時設置L4的兩塊玻璃材料為變量(選擇Slove Type類型為Substitute)。首先采用“Optimization”進行自動優(yōu)化，然后選擇“Hammer Optimization”進一步錘形優(yōu)化，通過改變r值、d值和玻璃材料的方法來優(yōu)化發(fā)射光路結構，優(yōu)化后的發(fā)射光路結構參數(shù)如表5所示，其三維圖和渲染圖如圖15所示。

表5 優(yōu)化后的發(fā)射光路結構

圖15 發(fā)射光路的三維圖與渲染圖Fig.15 3D layout and shaded model of emission lens

優(yōu)化后的發(fā)射光路的點列圖、MTF曲線分別如圖16和圖17所示。可見該發(fā)射光路的彌散斑尺寸小于10 μm，完全滿足目前激光共聚焦常用探測針孔直徑為50 μm～300 μm的實際應用需求。同時，由于物鏡L3的數(shù)值孔徑為0.2，發(fā)射光路工作波長為820 nm，由公式(2)計算可得發(fā)射光路的衍射分辨率為2.5 μm，由圖16可知，其在全視場空間頻率N=1/δ=400 lp/mm處的MTF>0.07[7]，因此該發(fā)射光路具有極高的光學傳輸效率。

圖16 發(fā)射光路的點列圖Fig.16 Spot diagram of emission lens

圖17 發(fā)射光路的MTF曲線Fig.17 MTF curves of emission lens

4 結論

本文采用激光共聚焦原理設計了近紅外熒光掃描系統(tǒng)，采用結構簡單的凹凸雙透鏡物鏡實現(xiàn)了照明光路和發(fā)射光路的設計。其中，照明光路的聚焦彌散斑小于1 μm；照明針孔處的聚焦光斑尺寸小于40 μm，滿足照明針孔的尺寸要求；發(fā)射針孔處的聚焦光斑小于10 μm，滿足探測針孔尺寸要求；同時照明光路和發(fā)射光路的MTF曲線的截止頻率都分別滿足其衍射極限分辨率的要求，具有較高的光學傳輸效率。因此，該光學系統(tǒng)具有結構簡單、工作于近紅外光譜區(qū)、分辨率高的優(yōu)點，可滿足生物芯片、基因 芯片等對激光共聚焦近紅外熒光掃描系統(tǒng)的需求。另外，本光學系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑較小，因此還可以采用較為復雜的顯微物鏡來進一步提高系統(tǒng)的數(shù)值孔徑，從而進一步提高激光共聚焦光學系統(tǒng)的光學分辨率和熒光探測效率。

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Optical design of near infrared fluorescence confocal laser scanning system

Luo Gangyin,Wang Bidou,Miao Peng,Wang Lei,Wang Zhongzhou,Qian Qing,Qian Jun

(CAS Key Lab of Bio-Medical Diagnostics，Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology，CAS,Suzhou 215163, China)

In order to realize the high resolution scanning for near infrared fluorescence，a laser scanning confocal optical system was designed which worked in the near infrared region.The lighting lens,and emission lens were realized based on simple concave lens and convex lens.The software Zemax was used for the optical design and simulation. Simulation results shows that the focal spot’s size of lighting lens is less than 1 μm, and the focal spot’s size is less than 40 μm at the lighting pinhole position, which meets the lighting pinhole’s requirement.The focal spot’s size is less than 10 μm at the emission pinhole position, which meets the emission pinhole’s requirement.In addition,the cutoff frequency of the lighting lens and emission lens meets the diffraction limit resolution requirement respectively. Therefore, it has high optical transmission efficiency.

optical design;near infrared fluorescence scanning;confocal laser scanning;Zemax

1002-2082(2015)01-0029-06

2014-08-25；

2014-09-18

中科院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所“一三五”規(guī)劃重大突破資助項目(Y052031205);蘇州市應用基礎研究計劃資助項目(SYG201128)

羅剛銀(1984-)，男，四川德陽人，助理研究員，主要從事生物光譜儀器方面的研究。E-mail：luogy1237@sina.com

TN24;TH703

A

10.5768/JAO201536.0101006