山東沂源硬蜱攜帶無形體的調查及進化分析

劉相葉，武志強，劉轉轉，湯仁仙，顏 超，鄭葵陽＊

（1.徐州醫(yī)學院病原生物學與免疫教研室，感染與免疫實驗室，江蘇徐州221004；2.Department of Biology，Colorado State University，F(xiàn)ort Collins，Colorado，80523，USA）

人粒細胞無形體?。℉uman granulocytic anaplasmosis，HGA）是一種嚴重威脅人類健康的新發(fā)人獸共患病，其病原體為嗜吞噬細胞無形體（Anaplasma phagocytophilum），是一種細胞內專性寄生的革蘭陰性菌，屬立克次體目（Rickettsiales）無形體科（Anaplasmataceae）無形體屬（Anaplasmas），可以感染人、嚙齒動物和反芻動物等多種哺乳動物［1－3］。硬蜱是介導嗜吞噬細胞無形體在人、家畜和野生動物之間循環(huán)傳播的主要媒介，我國分布廣泛的全溝硬蜱、森林革蜱、長角血蜱等均被視為嗜吞噬細胞無形體的傳播媒介［4］。血清學調查發(fā)現(xiàn)，我國HGA的流行呈現(xiàn)農村高于城市的趨勢（農村為15.4%，城市為1.5%）［5］，這可能與嗜吞噬細胞無形體在家畜和硬蜱體內的高感染率有關（山羊26.69%、牛23.38%、長角血蜱43.5%）［6－7］。

山東省沂源縣地處魯中腹地，自2004年以來，不斷有當?shù)剞r民確診HGA 的報告；血清學調查顯示，這些農民HGA 抗體陽性率是全國平均水平的2倍［5，8］。該地區(qū)農民除作物耕種以外，多從事山羊養(yǎng)殖。每年春夏季節(jié)的蜱蟲活躍期，山羊體表有大量的硬蜱寄生，并且時有蜱咬人事件的發(fā)生。為了解這一地區(qū)硬蜱感染嗜吞噬細胞無形體的情況，本課題組于2015年5月～7月的硬蜱活躍期，以家養(yǎng)或野外放養(yǎng)山羊為對象，采集寄生于山羊體表的硬蜱。采用套式PCR 擴增嗜吞噬細胞無形體的16SrRNA基因片段并測序，鑒定蜱蟲嗜吞噬細胞無形體并分析其16SrRNA 基因的變異情況，為當?shù)豀GA 的預防提供參考意見。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 調查地點 沂源縣位于山東省中部，是淄博、萊蕪、臨沂、濰坊四市的結合部，地理坐標：東經117°54′～118°31′，北緯35°55′～36°23′之間，屬溫帶季風區(qū)域大陸性氣候。

1.1.2 樣本采集 本次調查選取有疑似HGA 病例的自然村開展硬蜱調查，采用體表視檢法采集不同地區(qū)家養(yǎng)或野外放牧山羊體表寄生的硬蜱。采集的硬蜱保存在通氣干燥的細胞培養(yǎng)瓶內，12h內帶回實驗室進行分類鑒定和病原檢測。

1.1.3 主要試劑 DNA 提取試劑盒，德國QIAGEN 公司產品；Taq DNA 聚合酶、10×PCR 緩沖液、dNTP混合物，寶生物工程（大連）有限公司產品；無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據文獻報道［7，9］，合成無形體16SrRNA 基因內外引物各一對，蜱蟲16SrRNA基因引物一對；引物名稱及序列見表1。所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用滅菌去離子水稀釋至100μmol／L分裝，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR 引物Table 1 The primers for PCR

1.2.2 樣本DNA 的提取 采集的硬蜱樣本分類鑒定后分組，若蜱每組3只～4只，成蜱每組1只。每組單獨放在含有750mL／L 酒精的EP 管內浸泡30min，再用滅菌去離子水洗滌3次，晾干。分別置于含有200μL 1×PBS 的研磨管內，在快速樣品均質器上室溫條件下均質，均質程序為：6m／s運行40 s，暫停300s，共2個循環(huán)。稍離心后，取180μL 均質液，置于滅菌EP管內，按照DNA 提取試劑盒說明提取樣本DNA。按同樣操作提取無菌水作陰性對照。

1.2.3 PCR 擴增 無形體16SrRNA 基因的擴增采用套式PCR，第一輪擴增使用通用引物EH－out1和EH－out2，25μL 反應體系成分如下：1.2.2中提取的DNA 1μL 為模板，加入相應的上、下游引物（10μmol／L）各1 μL，Ex Taq DNA 聚 合 酶（5 U／μL）0.1 μL，10×PCR 緩 沖 液（20 mmol／L Mg2＋Plus）2.5μL和dNTP 混合物（2.5mmol／L）2.0μL，補去離子滅菌水到25μL，瞬時離心混勻。反應程序如下：94℃預變性5 min；94℃45s，55℃50s，72℃1min，40個循環(huán)；72℃延伸5min。第2輪反應以1μL第一輪產物為模板，擴增使用特異性引物HGA1和HGA2，反應體系和反應條件同第一輪，擴增片段預期大小為389bp。取10μL 擴增產物通過10g／L的瓊脂糖電泳，觀察結果。

1.2.4 序列分析 無形體16SrRNA 基因片段的PCR 產物經核酸電泳鑒定大小正確后，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果提交GenBank并進行16SrRNA 基因序列核苷酸同源性比較和查詢，并采用ClustalX2.0進行多序列的排列和進化軟件MrBaye3.2.5 繪制基因進化樹［10］。

2 結果

2.1 調查地區(qū)概況

山東沂源縣屬中低山丘陵區(qū)，多山林、草地，農業(yè)人口占80%，當?shù)剞r民多從事經濟作物種植與畜牧養(yǎng)殖（以養(yǎng)殖波爾山羊、黑山羊及紅山羊為主）。山羊主要以野外山林放養(yǎng)為主，體表寄生有大量硬蜱，雖做殺蟲處理，但是效果不理想（圖1）。人與家畜接觸密切，常有蜱蟲叮咬事件的發(fā)生。

圖1 長角血蜱寄生于紅山羊耳背面Fig.1 H.longicornis on the back of red goat

2.2 樣本采集

本次調查從波爾山羊、黑山羊、紅山羊體表共采集硬蜱923只，經形態(tài)學與蜱蟲16SrRNA 擴增鑒定均為長角血蜱，隨機選取其中126 只（包括成蜱43只、若蜱83只），分別提取其核酸后做嗜吞噬細胞無形體病原檢測。

2.3 PCR 擴增

將126只硬蜱分為54組，分別提取DNA 進行套式PCR 擴增。26組產生389bp大小的預期片段（圖2），擴增陽性率為48.1%。

2.4 序列分析

26份陽性擴增產物全部測序成功，將陽性序列（362bp）利用ClustalX2.0進行比對，按照100%相似性進行歸類，結果共檢出7類變異株（分別命名為YT1～YT7，GenBank 注 冊 號 為 KT276559 ～KT276565），其中YT5 同其他序列存在顯著差異（圖3）。YT1占檢出序列的11.5%（3／26）與2012年日本全溝硬蜱體內檢出的嗜吞噬細胞無形體序列（JQ622148）的同源性達99%，并且與2007年山東沂源發(fā)熱病人體內檢出的無形體序列YYH3（EU982709）保持較近的進化關系（圖4）；YT2占檢出序列的50%（13／26）是本次所有檢出變異株中的優(yōu)勢菌株，與2010年日本長角血蜱體內檢出的牛無形體序列（EU181143）同源性達98%，同時與YT7保持密切的遺傳關系（圖4）；YT3 占檢出序列的11.5%（3／26），與2010年我國湖北隨州長角血蜱體內檢出的嗜吞噬細胞無形體序列（HM641751）具有99%的同源性，遺傳進化分析顯示YT3與2007年山東沂源山羊體內檢出的無形體序列YYS3（EU982704）遺傳關系較近（圖4）；YT4和YT6均占檢出序列的0.4%（1／26）與2009年北京牛體內檢出的嗜吞噬細胞無形體序列（GQ500018）同源性較高，并與2007年山東沂源長角血蜱體內檢出的無形體序列（EU982710）保持密切的遺傳關系（圖4）。

圖2 長角血蜱標本DNA 提取物PCR 擴增結果Fig.2 PCR results of 16SrRNA gene of Anaplasmain H.longicornis samples

圖3 無形體16SrRNA 基因序列比對結果Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of 16SrRNA gene of Anaplasma

圖4 無形體16SrRNA 基因的遺傳進化樹Fig.4 Phylogenic tree of 16SrRNA gene of Anaplasma

3 討論

嗜吞噬細胞無形體的主要傳播媒介是硬蜱［11］。調查數(shù)據顯示，在我國的全溝硬蜱、森林革蜱、長角血蜱等體內均可檢測到嗜吞噬細胞無形體的16S rRNA 基 因 序 列［12－14］。山 東 省 沂 源 縣 地 處 魯 中 腹地，是淄博、萊蕪、臨沂、濰坊四市的交界處，家畜及野生動物流動較大。長角血蜱作為該地區(qū)的優(yōu)勢蜱種，大量寄生于家畜體表，給畜牧業(yè)生產造成了極大的危害；而且常有蜱咬人事件發(fā)生，給當?shù)鼐用窠】祹砹藝乐赝{。本次調查結果顯示，山東沂源長角血蜱體內嗜吞噬細胞無形體的陽性率為48.1%，明顯高于2009年本地硬蜱體內17.6%的陽性檢出率［8］，同時也高于山東萊州灣地區(qū)長角血蜱體內43.5%的陽性檢出率［7］，說明該地區(qū)是人粒細胞無形體病的重要自然疫源地。

本次調查采用具有高度保守的嗜吞噬細胞無形體16SrRNA 基因作為分類和鑒定標準。54份長角血蜱標本中，26份擴增出嗜吞噬細胞無形體的16 S rRNA 基因，提示山東沂源地區(qū)山羊體表寄生的長角血蜱存在較高的無形體感染率，而山羊極有可能是該地區(qū)無形體病的重要儲存宿主。將測序獲得的16SrRNA 基因序列（362bp）進行比對分析發(fā)現(xiàn)，26份樣本中存在7個嗜吞噬細胞無形體的變異株，但其中1株（YT5）與其他6株存在較大差異，可能是測序或克隆錯誤所致。其余5 株16SrRNA基因序列分別與中國湖北隨州長角血蜱、北京牛、日本全溝硬蜱體內檢出的嗜吞噬細胞無形體序列保持非常高的同源性，但相似性未達到100%，說明不同地方嗜吞噬細胞無形體會存在一定的變異。還有1株與日本長角血蜱體內檢出的牛無形體同源性較高，可能是由于389bp 16SrRNA 基因的測序只能初步鑒定出嗜吞噬無形體感染的陽性樣本，但是不能準確鑒定無形體屬種型有關［15］。遺傳進化分析顯示，6個變異株均與2007 年山東沂源發(fā)熱病人、山羊、長角血蜱體內檢出的無形體保持非常密切的遺傳進化關系，說明該地區(qū)嗜吞噬細胞無形體的不同變異株可能來自同一祖先，但是否是同一基因型，還需要進一步研究。

結合以往的HGA 現(xiàn)場流行病學與實驗室調查［8，16］，本研究可以證實山東省沂源地區(qū)是重要的HGA 自然疫源地。值得我們注意的是，作為該病媒介的長角血蜱的嗜吞噬細胞無形體的攜帶率比2009年增長了1.7倍［8］，并且該地區(qū)出現(xiàn)了更多的變異株。山東沂源地區(qū)大部分山羊都由農民放養(yǎng)，山羊體表寄生有大量長角血蜱，農民和基層獸醫(yī)與山羊都有著密切地接觸，隨時有被蜱蟲叮咬的可能。所以有必要對當?shù)剞r民、獸醫(yī)加大蜱蟲防控的宣傳力度，防止HGA 發(fā)生大規(guī)模暴發(fā)。

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