段立群，姚曉東，張 淵， 周旭美

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠免疫功能的影響

段立群，姚曉東，張 淵， 周旭美

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

目的 研究石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法 40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、石斛復(fù)方制劑低劑量組、中劑量組及高劑量組各10只。采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠非特異性免疫功能的影響，并測定脾臟、胸腺指數(shù)；采用ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)觀察石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。另取40只小鼠，同法分組，采用半數(shù)溶血值(HC50)實(shí)驗(yàn)考察石斛復(fù)方制劉對(duì)小鼠體液免疫功能的影響。結(jié)果 石斛復(fù)方制劑能夠顯著升高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)；提高小鼠的HC50；刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖。結(jié)論 石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有不同程度的增強(qiáng)作用。

石斛復(fù)方制劑；小鼠；免疫功能

金釵石斛為蘭科石斛屬植物，是我國的名貴中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，其性寒、味甘，具有滋陰清熱、生津養(yǎng)胃、潤肺止咳，名目強(qiáng)身等功效，因其特殊的生存環(huán)境和明顯的滋補(bǔ)功效而享有“民間仙草、植物黃金”的美譽(yù)[1]，其主要有效成分為多糖和生物堿[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石斛具有治療眼病、抗衰老及免疫調(diào)節(jié)、收縮腸管、抗腫瘤和抗菌等[3-5]功效；黃芪具有免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑的作用，同時(shí)具有一定的抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗應(yīng)激、抗氧化等[6]作用；黨參具有健脾益肺、養(yǎng)血生津[7]之功效。石斛復(fù)方制劑由金釵石斛(產(chǎn)自貴州赤水)、黨參及黃芪3味藥材合理組方而成，本實(shí)驗(yàn)旨在考察石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠免疫功能的影響，為石斛復(fù)方制劑進(jìn)一步開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 金釵石斛(貴州赤水)、黨參(山西)、黃芪(內(nèi)蒙)，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科楊建文教授鑒定為Dendrobiumnobile Lindl.、Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.、Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. varmongholicus(Bge.)Hsiao。石斛復(fù)方制劑(3種藥材的用量分別為金釵石斛15g、黨參25g、黃芪25g，用40倍量水，80 ℃提取3次，每次2.0 h，減壓濃縮至1 g/mL)、20%(v/v)雞紅細(xì)胞、生理鹽水、Giemsa染液、甲醇、丙酮、20%(v/v)綿羊紅細(xì)胞(批號(hào) 20131119，鄭州九龍生物制品有限公司)、SA液、補(bǔ)體(8只豚鼠的混合血清)、都氏試劑、Hank’s液、RPMI-1640培養(yǎng)基、100 μg/mL刀豆蛋白A(ConA)、鹽酸、異丙醇、小牛血清、青霉素、鏈霉素、5 mg/mL MTT(批號(hào) M8180，250 mg)。

1.1.2 儀器 SartoriusBS224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京譜析通用儀器有限公司)、D-37520離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)、DK-2000-IIIL電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、Olympus IX71型倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)、Thermo 3131型CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)、Thermo 3001-1913型酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Balb/c小鼠，雄性，18～22 g，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)20120003。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 40只小鼠隨機(jī)選取10只為對(duì)照組，石斛復(fù)方制劑高劑量組(HD)、中劑量組(MD)及低劑量組(LD)各10只。低、中、高劑量依次為3.5、6.0及8.5 g·kg-1。對(duì)照組給以0.3 mL蒸餾水。每日灌胃1次，連續(xù)給藥30 d。另取40只小鼠，同法分組及給藥，用于半數(shù)溶血值的測定。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[8]第30天給藥后2 h，每只小鼠腹腔注射20% CRBC (雞紅細(xì)胞)1 mL，輕揉腹部，1 h后，頸椎脫臼處死小鼠，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹部，腹腔給予生理鹽水1 mL，旋轉(zhuǎn)鼠板，使腹腔液與生理鹽水混勻，注射器吸取腹腔液，分別滴于2片載玻片上，置37 ℃孵箱溫育1 h，孵畢，生理鹽水漂洗，晾干，固定液(甲醇:丙酮=1∶1)固定1 min，漂洗，Giemsa染液染色3 min，漂洗，將染色載玻片放于烘箱中烘干，油鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞雞紅細(xì)胞情況并計(jì)數(shù)，每張載玻片計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，按下式分別計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

1.2.3 石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠免疫器官的影響[9]第30天給藥后稱重，2 h后頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠的胸腺、脾臟稱重，按下式分別計(jì)算臟器指數(shù)。

1.2.4 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[8]將小鼠脫頸椎處死，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的平皿中，用鑷子除去多余組織，用剪刀將脾臟剪碎，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，成單細(xì)胞懸液，用Hank’s液洗1次，之后用等體積培養(yǎng)基洗1次，1 500 r/min，每次離心10 min，棄去上清液，加入2 mL完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，移取10 μL細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基稀釋20倍，移取稀釋后的細(xì)胞懸液20 μL于計(jì)數(shù)板上，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。將每一份調(diào)整好細(xì)胞濃度的脾細(xì)胞懸液分2孔加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，其中一孔加入75 μL ConA液，另一孔作為對(duì)照，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h后，取出培養(yǎng)板，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不完全培養(yǎng)基，同時(shí)每孔加入MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，用移液器吹打均勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每孔做3個(gè)平行孔，酶標(biāo)儀在570 nm處測定各孔光密度值。加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值即代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.2.5 半數(shù)溶血值(HC50)的測定[8]每只小鼠腹腔注射2% SRBC (綿羊紅細(xì)胞)0.2 mL，免疫5天，第30天給藥后90 min，摘除眼球取血于1 mL EP管內(nèi)，靜置2.0 h，2 000 r/min離心10 min，取血清用SA緩沖液稀釋200倍，取稀釋后的血清1 mL于4 mL EP管內(nèi)，依次加入10% SRBC 0.5 mL、補(bǔ)體1 mL (用前用SA緩沖液按1:8稀釋)，另設(shè)不加血清(用SA緩沖液代替)的對(duì)照管作為空白，置37 ℃恒溫水浴中保溫30 min，冰浴終止反應(yīng)，2 000 r/min離心10 min。取上清液1 mL，加都氏試劑3 mL于試管內(nèi)，同時(shí)取10% SRBC 0.25 mL于另一試管，加都氏試劑至4 mL，充分混勻，放置10 min。于540 nm處分別測定各管的光密度值，按下式計(jì)算HC50。

2 結(jié)果

2.1 石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 與對(duì)照組比較，對(duì)吞噬百分率的影響，中、高劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，分別較對(duì)照組提高了21.86%、40.08%；對(duì)吞噬指數(shù)的影響，低、中、高劑量組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，分別較對(duì)照組提高20.95%、25.69%、45.45%。在油鏡下觀察：空白組吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)很少，基本沒有吞噬2個(gè)以上雞紅細(xì)胞，且巨噬細(xì)胞較為分散；而給藥組吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)較多，并隨給藥劑量的增大而增加，尤其石斛復(fù)方制劑高劑量組巨噬細(xì)胞聚集現(xiàn)象明顯，且吞噬2個(gè)以上雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)較多(見圖1，表1)。

A：空白組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組。

組別劑量(g·kg-1)吞噬率(%)吞噬指數(shù)(%)空白組024．7±4．850．253±0．048石斛復(fù)方制劑低劑量組3．529．1±4．860．306±0．048?石斛復(fù)方制劑中劑量組6．030．1±6．84?0．318±0．069?石斛復(fù)方制劑高劑量組8．534．6±5．85??0．368±0．058??

與空白組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.2 石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，對(duì)脾臟指數(shù)的影響，低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中、高劑量組分別較對(duì)照組提高了1.95%、2.68%(P<0.05)；對(duì)胸腺指數(shù)的影響，低劑量組對(duì)沒有顯著變化(P>0.05)，中、高劑量組分別較對(duì)照組提高了2.00%、2.37%(P<0.05,見表2)。

組別劑量(g·kg-1)脾臟指數(shù)(mg·g-1)胸腺指數(shù)(mg·g-1)空白組04．089±0．0781．201±0．030石斛復(fù)方制劑低劑量組3．54．158±0．1021．222±0．027石斛復(fù)方制劑中劑量組6．04．169±0．094?1．225±0．020?石斛復(fù)方制劑高劑量組8．54．199±0．044??1．229±0．018?

與空白組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.3 石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響 與對(duì)照組比較，低劑量組沒有顯著變化(P>0.05)，中、高劑量組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

2.4 石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠體液免疫功能的影響 與對(duì)照組比較，低劑量組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中、高劑量組均可使小鼠的抗體水平明顯增高(P>0.05，見表4)。

組別劑量(g·kg-1)淋巴細(xì)胞增殖能力空白組00．189±0．022石斛復(fù)方制劑低劑量組3．50．203±0．012石斛復(fù)方制劑中劑量組6．00．205±0．015?石斛復(fù)方制劑高劑量組8．50．207±0．016?

與空白組比較，*P﹤0.05。

組別劑量(g·kg-1)血清溶血素(HC50)空白組0119．97±8．73石斛復(fù)方制劑低劑量組3．5127．29±9．17石斛復(fù)方制劑中劑量組6．0129．56±9．46?石斛復(fù)方制劑高劑量組8．5132．18±11．10??

與空白組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

3 討論

石斛復(fù)方制劑系有金釵石斛、黃芪、黨參3味藥材組成，其中，金釵石斛具有抗衰老及免疫調(diào)節(jié)的作用[1]；黃芪為扶正固本的常用中藥，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抑制流感等多種病毒所致細(xì)胞病變；促使細(xì)胞生長旺盛等作用[10]；黨參具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力的作用，能夠起到補(bǔ)中益氣，健脾益肺之功效[11]。該復(fù)方制劑以金釵石斛益氣生津、滋陰清熱為主，輔以黨參補(bǔ)中益氣，健脾益肺，黃芪補(bǔ)氣行血。諸藥合用，清除機(jī)體虛熱，平補(bǔ)氣血，通過多種途徑增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。本實(shí)驗(yàn)從小鼠的非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫功能等方面研究了石斛復(fù)方制劑對(duì)小鼠免疫功能的影響。

巨噬細(xì)胞是一種非特異性免疫細(xì)胞，也是一種典型的炎癥細(xì)胞，能夠吞噬和消滅外來異物以及自身死亡的細(xì)胞，因此，巨噬細(xì)胞吞噬活性的大小在一定程度上反應(yīng)了機(jī)體的非特異性免疫功能，利用巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，可以在體外觀察巨噬細(xì)胞的吞噬功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量組均能明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，而中、高劑量還能夠顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率。

胸腺和脾臟是動(dòng)物重要的免疫器官，其重量也在一定程度上反映了機(jī)體的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高劑量復(fù)方制劑均能使小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯增加。

T淋巴細(xì)胞受到ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞增殖反應(yīng)，增殖細(xì)胞中的線粒體水解酶可將MTT分解為蘭紫色結(jié)晶，其光密度值反映了淋巴細(xì)胞的增殖能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高劑量復(fù)方制劑能夠顯著增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力。

用綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫小鼠數(shù)天，能夠刺激小鼠B細(xì)胞產(chǎn)生抗SRBC抗體，用免疫后的小鼠血清在體外與定量SRBC作用，小鼠血清對(duì)SRBC的溶解能力(HC50)反映了小鼠抗體分泌細(xì)胞分泌抗體的能力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，中、高劑量復(fù)方制劑能夠明顯增強(qiáng)小鼠抗體分泌細(xì)胞分泌抗體的能力。

綜上所述，石斛復(fù)方制劑能夠提高小鼠非特異性和特異性免疫功能，具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，可作為一種免疫調(diào)節(jié)劑使用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，有良好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

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[收稿2014-09-25;修回2014-11-07]

(編輯：譚秀榮)

Immunological effect of caulis dendrobii compound preparation in mice

DuanLiqun,YaoXiaodong,ZhangYuan,ZhouXumei

(School of Pharmacy, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To study immunological effect of caulis dendrobii compound preparation in mice.Methods 40 mice were randomly divided into 4 groups: Normal Group (NG), Low Dose Group of CDCP (LDG), Medium Dose Group of CDCP (MDG) and High Dose Group of CDCP (HDG), 10 mice each group. The nonspecific immunological effect of Caulis dendrobii compound preparation in mice was carried out by macrophages swallowed erythrocyte, and by the spleen and thymus index. The cellular immunity activity in mice was tested using Con A-induced spleen lymphocyte transformation test. Another 40 mice were treated as above, and the humoral immune effects were tested using HC50.Results Caulis dendrobii compound preparations significantly increased phagocytic rate, phagocytic index, and HC50in mice. In addition, Caulis dendrobii compound preparations stimulated spleen lymphocyte proliferating.Conclusion Caulis dendrobii compound preparations may increase immunological functions to different degrees in mice, including nonspecific immune, humoral immune and cellular immune functions.

Caulis dendrobii compound preparation；mice；immunological function

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(NO：黔科合重大專項(xiàng)字20086002)。

周旭美，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：新藥研發(fā)，E-mail：546265853@qq.com。

R96

A

1000-2715(2015)01-0041-04