張紅燕，鄭代軍，李長福，楊加偉，陳永正

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

單加氧酶基因篩選表達(dá)及其在苯甲亞砜中的合成應(yīng)用

張紅燕1,2，鄭代軍1，李長福2，楊加偉2，陳永正1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 克隆和表達(dá)假單胞菌菌株P(guān)seudomonasmonteiliiCCTCC M2013683的單加氧酶基因并研究其在手性亞砜合成中的應(yīng)用。方法 根據(jù)假單胞菌菌株P(guān)seudomonasmonteiliiCCTCC M2013683基因組序列，選取3個(gè)單加氧酶基因設(shè)計(jì)特異性的PCR引物，利用PCR技術(shù)，以菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-pmmo，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。以構(gòu)建的重組菌為生物催化劑，苯甲硫醚為底物進(jìn)行催化反應(yīng)。結(jié)果 擴(kuò)增獲得了3個(gè)目的基因并構(gòu)建了相應(yīng)的重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)的3個(gè)重組蛋白中有2個(gè)(pmmo-3546、pmmo-6814)具有活性，可催化苯甲硫醚轉(zhuǎn)化為R構(gòu)型的苯甲亞砜。結(jié)論 成功獲得了具有R-選擇性催化苯甲硫醚活性的單加氧酶重組蛋白。

單加氧酶; 苯甲硫醚；生物催化；手性亞砜

手性亞砜是重要的手性輔劑、手性配體和手性藥物中間體[1-3]。例如，手性亞砜可用于重要手性胺類和手性氨基酸及多種天然產(chǎn)物的合成[4-7]。另外，胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及反流性食管炎的治療均需用到質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑、蘭索拉唑、雷貝拉唑等，而該類質(zhì)子泵抑制劑均含有亞砜活性基團(tuán)[8]。所以對潛手性的硫醚的不對稱催化以取得高光學(xué)純度的亞砜具有重要意義。單加氧酶是有機(jī)氧化反應(yīng)中是起關(guān)鍵作用的生物催化劑，通常具有較高的對映或區(qū)域選擇性[9-11]。

課題組在前期研究中從西南地區(qū)土壤中成功篩選出了高活性、高選擇性和高底物耐受性的硫醚單加氧酶產(chǎn)生菌株假單胞菌PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683，以該菌株作為催化劑氧化芳香硫醚類底物，在底物濃度30 mM情況下，獲得了大于99%產(chǎn)率和99%對映選擇性的手性苯甲亞砜[12]。在此基礎(chǔ)上，我們對該菌株進(jìn)行全基因組測序分析，從測序結(jié)果中篩選單加氧酶基因，并構(gòu)建基因工程菌，以整細(xì)胞作為生物催化劑，研究催化苯甲硫醚合成苯甲亞砜的不對稱氧化反應(yīng)，為后續(xù)的深入研究建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683由本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)質(zhì)粒pET-32a購于長沙贏潤生物技術(shù)有限公司；pGEM-T Easy Vector 購于普洛麥格生物技術(shù)有限公司；基因組DNA Ligation Kit Ver.2.1、Taq DNA Polymerase、DNA連接試劑盒、購于TaKaRa Biotech公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和 Hind Ⅲ購于thermo science； IPTG 、氨芐青霉素購于北京索萊寶公司；DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、宿主菌E.coliBL21(DE3) 、E.coliDH5α購于北京博邁德基因技術(shù)有限公司 AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購于康寧生命科學(xué)有限公司；苯甲硫醚購于百靈威 ；其余試劑為國產(chǎn)分析純。擴(kuò)增目的基因引物如表1所列。引物序列中下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)，引物由北京博邁德生物公司合成。

表1 引物序列

基因名稱引物序列pmmo3538hsaBFACCGGGATCCATGATCGAACCAGGCATCpmmo3538hsaBRCCTTAAGCTTACCCAAGGGGGGCApmmo3546hsaBFCTGCGGATCCATGATCGACGCAACCGTCTpmmo3546hsaBRAACCAAGCTTGGCAAAGGCCGGCAGpmmo6814ntaBFACTCGGATCCATGCAGACCGTTGAACACGAATpmmo6814ntaBRACCGAAGCTTGTAGGCTTTGTCCCAGCT

1.2 蒙氏假單胞菌基因組DNA的提取 按照TaKaRa 試劑盒提供的方法操作，主要步驟如下：1.5 mL Tube收集細(xì)菌，10 000 g離心2 min，棄上清，加入180 μL的Buffer GL、20 μL的Proteinase K和10 μL的RNase A(10 mg/mL)，充分吸打混勻，置于56 ℃水浴中溫浴10 min。 接著加入200 μL的Buffer GB和200 μL100%乙醇，充分吸打混勻。溶液移至Spin Column中，10000 g離心2 min，棄濾液。加入洗脫液清洗2次，棄濾液，在Spin Column膜的中央處加入50 μL Elution Buffer，室溫靜置5 min。10000 g離心2 min洗脫DNA，-20 ℃保存。

1.3 pmmo的擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板，使用表1中的引物擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL 、基因組DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min； 98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s循環(huán)；72 ℃延伸10 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證是否獲得符合目的基因大小的片段。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建 按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒操作方法回收PCR產(chǎn)物?；厥盏腜CR產(chǎn)物通過T-A克隆方法連接于pGEM-T Easy載體，連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定后，抽取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)一步雙酶切驗(yàn)證，陽性克隆送至北京博邁德公司測序，驗(yàn)證序列是否正確。測序驗(yàn)證序列正確的陽性重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，載體pET32a(+)對應(yīng)雙酶切，酶切回收的目的片段和載體16 ℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)長出的單克隆菌落經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后，抽提質(zhì)粒雙酶切，陽性重組質(zhì)粒pET32a-pmmo和空載體pET32(a+)分別轉(zhuǎn)化于E.coliBL21(DE3)中，涂布于含氨芐青霉素終濃度為100 μg/mL的抗性平板，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)12～16 h。單菌落經(jīng)驗(yàn)證后的陽性重組子甘油(終濃度為20%)保存于-80 ℃冰箱。

1.5 重組蛋白表達(dá) 保存于甘油中的重組菌pET32a-pmmo/BL21(DE3)和空質(zhì)粒對照菌pET32a/BL21(DE3)菌經(jīng)劃線復(fù)活后，用滅菌10μL吸頭挑單菌落于3 mL含相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，取1%接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的含抗生素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 rpm振蕩培養(yǎng)OD600為0.6 (約3h)，加入IPTG(終濃度)為0.5 mM，25 ℃ 160 rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。誘導(dǎo)結(jié)束后4 500 g離心5 min收集菌體，菌體重懸于PBS(50 mM，pH=7.0)中，菌濃度為50g/L。利用細(xì)胞破碎儀破碎菌體(9 Mpa)，15 000 g離心5 min去細(xì)胞碎片，取上清與5x上樣緩沖液混合后，于恒溫金屬浴中100 ℃加熱8 min后作SDS-PAGE電泳分析。

1.6 重組菌生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)及檢測 5 mL的反應(yīng)體系中加入2 mM的苯甲硫醚和0.25 g濕菌體，30 ℃，250 rpm振蕩反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后加入5mL乙酸乙酯振蕩終止反應(yīng)，萃取反應(yīng)的底物和產(chǎn)物，離心取上層有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，取上清300 μL于樣品瓶中，并加入同等體積的異丙醇，經(jīng)HPLC分析，依據(jù)峰面積計(jì)算產(chǎn)物產(chǎn)率和光學(xué)純度。使用高效液相色譜儀對苯甲亞砜進(jìn)行手性分析，流動(dòng)相正己烷/異丙醇(93:7，v/v)，流速為0.7 mL/min，檢測器波長為254 nm，使用OD-H柱(Daicel, 4.0 mm Ф×10 mmL)，(R)-苯甲亞砜的出峰時(shí)間為16.6 min，(S) -苯甲亞砜的出峰時(shí)間為23.0 min。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA的提取與單加氧酶擴(kuò)增產(chǎn)物 利用DNA提取試劑盒順利獲得了PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683菌株基因組DNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1A所示：條帶整齊均一且無RNA殘留，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以蒙氏假單胞菌基因組DNA為模板，利用所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了大小約為500 bp的pmmo-3538和pmmo-3546基因，以及大小約為1 000 bp的pmmo-6814基因，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1B所示。最后將3個(gè)單加氧酶基因克隆至pGEM-T Easy載體并測序以確保序列正確。

A：基因組DNA電泳圖，1：marker；2：基因組DNA；B：3個(gè)單加氧酶的PCR產(chǎn)物電泳圖，1：marker ；2：pmmo-3538；3：pmmo-3546；4：pmmo-6814，條帶大小分別為483bp，483bp，969bp。

2.2 目的基因的序列測定和表達(dá)載體的構(gòu)建 雙酶切3個(gè)目的基因與表達(dá)載體pET32a(+)后進(jìn)行體外連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，每個(gè)基因挑選3個(gè)轉(zhuǎn)化后的單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定。圖2A中的結(jié)果顯示：所有樣品均通過菌液PCR擴(kuò)增到了符合預(yù)期大小的基因片段，表明挑選的3個(gè)基因的單菌落均為陽性克隆。接著，本研究抽提以上陽性重組子的質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示(見圖2B)所有重組質(zhì)粒均通過酶切獲得了與預(yù)期大小相符的目的片段條件。以上數(shù)據(jù)表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，陽性重組質(zhì)粒接下來轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)中來進(jìn)行后續(xù)的蛋白表達(dá)研究。

A：重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-pmmo菌液PCR鑒定結(jié)果，1：marker；2～4：pmmo-3538 不同單克隆；5～7：pmmo-3546 不同單克隆 ；8～10：pmmo-6814 不同單克??；箭頭所指為目標(biāo)條帶，下同；B：重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-pmmo BamHⅠ和HindⅢ雙酶切結(jié)果，1：marker；2～4：pmmo-3538 不同單克??；5～7：pmmo-3546 不同單克隆 ；8～10：pmmo-6814 不同單克隆。

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的重組菌與空質(zhì)粒菌離心收集后高壓破碎，離心去細(xì)胞碎片等不溶物，取上清作SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示：與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的3個(gè)重組菌均表達(dá)出了大量的重組蛋白，大小分別為17、17、35 KD。由于重組蛋白帶有載體上的標(biāo)簽，所以其大小均比相應(yīng)的內(nèi)源表達(dá)蛋白大20 kD，重組蛋白大小與預(yù)期相符。結(jié)果說明重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

2.4 重組菌生物轉(zhuǎn)化反應(yīng) 收集將誘導(dǎo)表達(dá)后的3個(gè)重組菌和1個(gè)含空質(zhì)粒的對照菌，以重組菌作為催化劑催化苯甲硫醚，HPLC檢測苯甲亞砜的生成情況。表2中的結(jié)果顯示：以含空質(zhì)粒的對照菌pET32a/BL21(DE3)催化劑基本無苯甲亞砜的生成，且無選擇性(轉(zhuǎn)化率僅為2.2%)。與對照菌相比，以含有重組質(zhì)粒pET32a-pmmo-3546和pET32a-pmmo-6814的重組菌為催化劑，檢測到了明顯的苯甲亞砜產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率分別為2.9% 和8.5%，且產(chǎn)物均為R構(gòu)型。以上數(shù)據(jù)說明本研究克隆和表達(dá)的單加氧酶蛋白具有催化苯甲硫醚活性和較高的對映選擇性。

M：marker 1：BL21(pET32a)加IPTG誘導(dǎo)；2、4、6分別為BL21(pET32a-pmmo-3538)、BL21(pET32a-pmmo-3546)、BL21(pET32a-pmmo-6814) 未加IPTG誘導(dǎo)；3、5、7為對應(yīng)的重組菌加IPTG誘導(dǎo)。

表2 重組菌催化苯甲硫醚轉(zhuǎn)化苯甲手性亞砜結(jié)果

序號底物重組菌編號底物濃度(mM)時(shí)間(h)ee(%)構(gòu)型轉(zhuǎn)化率(%)1苯甲硫醚35382240-4．22苯甲硫醚354622499(R)2．93苯甲硫醚681422459(R)8．54苯甲硫醚pET32a2240-2．2

3 討論

手性亞砜最直接有效的方法是對潛手性的硫醚化合物進(jìn)行不對稱氧化。利用金屬[13]和有機(jī)小分子[14]作為催化劑不對稱氧化硫醚，在反應(yīng)過程中存在過度氧化、副產(chǎn)物多、反應(yīng)條件苛刻等弊端[15-16]，而利用微生物細(xì)胞或酶(純酶和微生物體內(nèi)的酶)催化不對稱反應(yīng)合成手性亞砜，反應(yīng)條件溫和、無需極端溫度、壓力、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等化學(xué)反應(yīng)必需的條件[17]。另外，酶是有可再生資源制得，自身無毒且能在壞境中降解，并且其具有特殊催化結(jié)構(gòu)的手性催化劑，可與底物特異性的結(jié)合，能在溫和的條件下實(shí)現(xiàn)對手性化合物的高選擇性轉(zhuǎn)化。因此，充分利用本實(shí)驗(yàn)篩選的菌株結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物手段，充分挖掘海量基因組信息，從中找出可催化硫醚的單加氧酶基因，并構(gòu)建相應(yīng)的工程菌，以此作為催化劑催化苯甲硫醚轉(zhuǎn)化為手性亞砜。

本研究從前期的假單胞菌菌株全基因組測序結(jié)果選取了3個(gè)單加氧酶基因，為便于目的基因與原核表達(dá)載體pET32a(+)定向重組，在上游引物的5’端添加 BamHⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和4個(gè)保護(hù)性堿基；下游引物的5’端加入HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和4個(gè)保護(hù)堿基，并去除終止密碼。酶切位點(diǎn)的選擇取決載體的多克隆位點(diǎn)、外源基因序列本身的特性以及后續(xù)酶切反應(yīng)體系。在設(shè)計(jì)引物添加酶切位點(diǎn)時(shí)需要先檢查表達(dá)外源片段中含有哪些內(nèi)切酶位點(diǎn)，避免重復(fù)。另外需要注意啟始密碼子和終止密碼子的讀碼框不會(huì)移碼。重組蛋白在表達(dá)時(shí)，溫和的表達(dá)條件利于蛋白的合成緩慢進(jìn)行，便于蛋白正確折疊，形成更多的可溶性蛋白。

本研究中以構(gòu)建的工程菌作為催化劑時(shí)，轉(zhuǎn)化率較低，表明重組蛋白的催化活性低。重組蛋白的催化活性與酶本身的特性(結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量大小、活性中心構(gòu)象等)，反應(yīng)介質(zhì)，底物和產(chǎn)物等因素息息相關(guān)。重組菌表達(dá)出的蛋白形式也與催化活性相關(guān)，只有可溶性的蛋白具有催化活性，因此，下一步可優(yōu)化蛋白的表達(dá)條件，誘導(dǎo)重組蛋白最大量的可溶性表達(dá)。其次，硫醚底物對于生物酶具有一定的毒性，對酶的活性有抑制的作用，因此，尋求高效的生物酶催化硫醚底物的不對稱氧化反應(yīng)研究一直成為一個(gè)難點(diǎn)和挑戰(zhàn)性的工作。另外，在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的過程中，酶所處的環(huán)境對于其活性的影響較大，如反應(yīng)的溫度、pH值、反應(yīng)介質(zhì)等不適都會(huì)使酶的催化活性降低，甚至失去催化活性。所以，后期的研究中可對生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中的條件加以優(yōu)化，以提高其催化活性。

本研究從全基因組測序結(jié)果中選取了3個(gè)單加氧酶基因進(jìn)行克隆，成功克隆了篩選的基因，其中的2個(gè)單加氧酶基因表達(dá)的蛋白可催化苯甲硫醚生成R構(gòu)型的苯甲亞砜，具有一定的對映體選擇性，但其催化效率還有待于提供。后期工作中可對蛋白的序列進(jìn)行定向進(jìn)化和突變，以提高重組蛋白的催化活性。該工作為后期將深入研究PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683菌株基因組的信息，構(gòu)建高催化活性和高對映選擇性的工程菌。

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[收稿2014-11-26;修回2014-12-17]

(編輯：王福軍)

Cloning and expression of monooxygenase genes and their application in the synthesis of phenyl methyl sulfoxide

ZhangHongyan1, 2,ZhenDaijun1,LiChangfu2,YangJiawei2,ChenYongzheng1

(1.School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China；2.Department of Biochemistry, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective Cloning and expression of monooxygenase genes ofPseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683 were performed to investigate their application in the synthesis of chiral sulfoxides.Methods Based on the genome sequence ofPseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683, three monooxygenase genes were selected and specific PCR primers were designed. Afterwards, PCR technology was applied to amplify these genes using genomic DNA as template. Recombinant plasmids pET-32a-pmmo were then constructed and transformed into E. coli BL21 (DE3) for recombinant proteins expression. Finally, the genetically engineered bacteria expressing recombinant monooxygenase proteins were used as biocatalysts to catalyze thioanisole substrate.Results Three target genes were amplified and corresponding plasmids were constructed. Recombinant proteins pmmo-3546 and pmmo-6814 exhibit high activity towards thioanisole to form chiral sulfoxide withR-selectivity.Conclusion Recombinant monooxygenase proteins withR-selectivity catalytic activity for thioanisole were successfully obtained.

monooxygenase;thioanisole;biocatalysis;chiral sulfoxides

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：21262051)；貴州省國際合作資助項(xiàng)目(NO：QKHGZ-2011-7017)。

陳永正，男，博士，副教授，研究方向：生物催化與手性合成，E-mail:yzchen@zmc.edu.cn。

Q7

A

1000-2715(2015)01-0049-05