曹美林，李佳，鄧慧，殷網虎

(鎮(zhèn)江市中醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江212003)

菌種保存方法眾多，選取建立一種保存期長、占用空間小，簡便易行的保存方法，使菌種的生命以及生物學特征得到有效延續(xù)是廣大醫(yī)學工作者探討的重要課題[1，2]。我院微生物實驗室采用濾紙低溫冷凍法保存臨床菌株，取得了較好的效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌種 金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，菌株均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 臨床菌株 觀察對象為本室臨床分離菌株，包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌等。

1.1.3 菌株保存管 取新華定性濾紙，剪成大小約15mm×3.5mm，放入1.5ml帶蓋塑料離心管內，每管1~2片，將離心管編號，用離心管盒裝載，121℃滅菌30min后備用[3]。

1.1.4 培養(yǎng)基和儀器 營養(yǎng)瓊脂、SS培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板、麥康凱培養(yǎng)基等培養(yǎng)基由上?？片敿挝⑸锛夹g有限公司生產；珠海迪爾細菌鑒定系統(tǒng)及配套的細菌鑒定條；三洋Biomedical Freezer低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 保存方法 將室內質控菌種在血瓊脂培養(yǎng)基上分離純化，用消毒鉗子鉗上濾紙片于平板上刮取，每片盡可能刮取較多的菌苔。放于帶蓋塑料離心管內，蓋上蓋子，每菌36管，寫上菌名，置于低溫冰箱的-20℃冷凍保存。對于臨床日常分離出的陽性菌株，先分純目的菌，完成鑒定藥敏操作，然后用消毒小鉗子鉗上濾紙片留取部分剩余菌種，于-20℃冷凍保存，并詳細填寫保存登記本。

1.2.2 檢測方法 質控菌株：每月取出一支保存管，每周一用無菌鑷子夾出菌種紙片，在哥倫比亞血平板上輕輕涂抹，37℃培養(yǎng)復蘇。剩余紙片仍放回離心管內，迅速放冰箱冷藏保存。按照室內質控要求，每周用復蘇菌種做藥敏質控，同時做生化鑒定，觀察菌株生化特性。臨床菌株：根據(jù)保存時間的長短，按照保存期 6、12、18、24 個月，每個時間段分別隨機從本室保存菌庫內抽取目標菌株復蘇，檢測細菌的存活情況，并觀察菌落性狀、菌體形態(tài)，檢測有關生化指標，比較各菌株的生物學特性是否發(fā)生變化。包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌，數(shù)量均為3株。

2 結果

2.1 保存期內3株標準菌株變異情況 2011年11月起本室采用濾紙法保存的銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球(ATCC29213)3株標準菌株，定期按照本室的方法進行復蘇使用，至2013年12月底，菌種存活率均為100%。銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球(ATCC29213)在存活期內，細菌形態(tài)、染色特性、生化反應等均無明顯變化，藥敏質控結果非常穩(wěn)定，說明菌株未發(fā)生變異。詳細藥敏質控結果見表1。

表1 3株標準菌株保存2年期間藥敏MIC試驗結果與參照結果對比(μg/ml)

2.2 7種常見菌株的存活情況 在采用濾紙法保存 的臨床菌株庫中，從保存期分別為6、12、18、24個月的菌株中，隨機抽取銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌各3株。接種哥倫比亞血平皿和沙保羅瓊脂斜面培養(yǎng)基，經35℃培養(yǎng)18~24h，每個保存期抽取的21株菌存活率均為100%，菌落形態(tài)特征無明顯改變且生長良好。詳細結果見表2。

表2 不同保存期7種臨床常見菌的存活情況

2.3 本室臨床菌株保存情況 自2011年11月份本室采用濾紙法保存菌種以來，至2013年12月31日已保存菌株1300株。臨床分離菌株主要以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌等為主。詳細保存情況見表3。

表3 本室細菌庫中分離占前10位的菌種情況

3 討論

為了微生物檢驗的質控工作[4]，進行菌株的分子生物學特征和耐藥性變遷進行監(jiān)測，以及科研教學[5]等方面的需要，長期保存菌株已成為臨床微生物實驗室的重要工作。菌株的保存方法較多，有明膠片法[5]、磁珠保存法[6]、半固體法[7]、濾紙石蠟法[8]、濾紙法[9]、甘油-生理鹽水法[10]等等，在諸多菌種保存方法中，真空冷凍干燥法效果最佳，但由于設備要求高，制備程序繁雜、占用空間大等缺點，只適用于保存小批量菌種，如乳酸菌的保存等[11]，并不適合臨床大批量的菌種保存[12]。

我們采用濾紙法保存的菌種，通過2年對非苛養(yǎng)菌的觀察，保存的菌株性狀穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)菌種變異、死亡現(xiàn)象。由于我院檢出的苛養(yǎng)菌數(shù)量較少，未進行保存性能觀察。但相關文獻多提示[9]，用濾紙法保存的苛養(yǎng)菌時間較短，效果不是十分理想。楊旭等用濾紙法將流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌保存一年后，存活率分別是6/10、7/10，存在一定數(shù)量的菌種死亡現(xiàn)象[13]。而龐璐等以中藥茨實、山藥作為保養(yǎng)液，用濾紙法保存甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌 、肺炎鏈球菌2年，菌種未發(fā)生死亡，提示濾紙法配合中藥可以提高苛養(yǎng)菌保存周期[14]。

有作者[14]將濾紙條單獨包裝消毒，保存時臨時從包裝內取出，這樣做的缺點是多了一道環(huán)節(jié)，增加了污染的可能性，所以我們根據(jù)文獻[15]對方法進行了改良，省去這一環(huán)節(jié)，直接將濾紙條放入離心管內，然后進行消毒滅菌，應用幾年來未發(fā)現(xiàn)菌株污染的情況。

我們的應用體會是，純化菌株做完鑒定和藥敏，一定要在當日保存菌種，如果保存不及時，細菌老齡化，一方面容易發(fā)生變異，另一方面菌株容易死亡。至于質控菌株，根據(jù)經驗，可以在購進時，將菌種分離培養(yǎng)，用濾紙法分裝3~5年的用量，這樣可以保證實驗室每次使用的都是一代菌，從我們的使用情況來看，效果非常滿意。

綜上所述，濾紙片低溫冷凍法保存菌種材料簡單、經濟，操作方便、占用空間小，能避免因反復傳代而引起的菌種變異，是適合臨床實驗室大批量保存非苛養(yǎng)菌的一個好方法。

[1]楊應虹,羅有福,李子成.抗耐藥金黃色葡萄球菌新藥的研究進展[J].華西藥學雜志,2010,25(4):494-496.

[2]陸貞玉.食品中金黃色葡萄球菌及其檢測方法現(xiàn)況[J].預防醫(yī)學情報雜志,2010,26(11):892-894.

[3]干迪郁,任利珍,朱立軍.兩種不同的細菌菌種保存方法比較[J].中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥雜志,2010,17(1O):49-50.

[4]帥麗華,胡志堅,孫曉紅,等.臨床微生物檢驗質量保證和持續(xù)改進[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2012,30(5):456-458.

[5]王紅,何曉冬,王典高.明膠片菌種保藏法的應用[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2010,37(16):3138-3139.

[6]陳曉 燕,林光.微生物實驗菌種保存方式探討[J].臨床合理用藥,2014,7(10):129-130.

[7]彭俊華,薛榮利,張媛媛,等.三種常用方法保存臨床常見菌種的比較[J].甘肅科學學報,2012,24(3):88-89.

[8]文德學,王興林,胡忠惠,等.濾紙石蠟油法保存淋球菌初探[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013,29(5):698-699.

[9]文德學,顧雪梅,王興林等.菌種濾紙保存法的應用[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2013,10(11):1486-1487.

[10]彭孝斌.甘油-生理鹽水保存菌種方法介紹[J].預防醫(yī)學情報雜志,2014,30(11):933-935.

[11]Fonseca F,Cenard S,Passot S.Freeze-drying of lactic acid bacteria.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.),2015,1257:477-88.

[12]白毓謙.微生物實驗技術[M].濟南:山東大學出版社,1986:403.

[13]楊旭,劉曉莉,吳防,等.兩種簡便保存菌種的方法比較[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2008,5(20):1219-1220.

[14]龐璐,蘇盛通,陳惠業(yè),等.用中藥肉湯保存菌種的研究[J].中外健康文摘,2012,9(36):382-383.

[15]劉金鳳.藥品檢驗常用菌種的保存注意要點[J].中國實用醫(yī)藥,2014,9(l1):270-271.