楊景哲，陳鳳平，馮欣姝，溫海玲，耿琪瑛

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，承德 067000)

重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)深Ⅱ度燙傷模型大鼠創(chuàng)面愈合的影響*

楊景哲，陳鳳平，馮欣姝，溫海玲，耿琪瑛

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，承德 067000)

目的 研究外用重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)對(duì)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的影響。方法 90只Wistar大鼠建立深Ⅱ度燙傷模型，分為A、B、C三組，每組30只。A組：凡士林紗布覆蓋；B組：納米銀敷料覆蓋；C組：rhGM-CSF涂抹創(chuàng)面。傷后第1，4，7，10，14，21天，觀察創(chuàng)面病理學(xué)改變，按照酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中表皮生長(zhǎng)因子(EGF)水平，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)創(chuàng)面愈合過程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 病理學(xué)改變：A、B、C三組均在第10天出現(xiàn)明顯的上皮化；EGF水平逐漸上升，A組上升最慢，C組上升最快，第1，4天各組間及第7天A組與B組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第7天其余各組間及第10，14，21天各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量，A組、B組逐漸上升，C組在第14天達(dá)到峰值，第21天下降，第1天，B組與C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第4天各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第7，10，14，21天各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 rhGM-CSF可加速深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合。

重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；納米銀；燒傷創(chuàng)面；表皮生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

燒(燙)傷是常見的機(jī)體損傷，而深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的修復(fù)一直是燒傷科醫(yī)生關(guān)注的重點(diǎn)。創(chuàng)面外用藥物不僅要求使用方便、安全、藥物吸收快、不良反應(yīng)小，更要具有加速創(chuàng)面愈合的特點(diǎn)。納米銀、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF)在燙傷臨床治療中已廣泛應(yīng)用，為探討二者在深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面上皮化方面的優(yōu)勢(shì)，筆者在本實(shí)驗(yàn)中通過局部應(yīng)用rhGM-CSF、納米銀，對(duì)燙傷大鼠血液表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)水平及組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)，為深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220 g，雌雄各半，天津山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(津)2009-0001，大鼠于實(shí)驗(yàn)室條件下的動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度為(24±3)℃，常規(guī)配方飼料喂養(yǎng)和飲自來水。

1.2 試藥 納米銀醫(yī)用抗菌敷料(深圳市愛杰特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：120401)；rhGM-CSF凝膠(長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20120603)；水合氯醛(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：30037517)，EGF試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：46036285)，PCR試劑盒(博瑞克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：081308)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，批號(hào)：00141145)。

1.3 儀器 UV2201型紫外分光光度計(jì)(日本島津)，PTC-220PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ公司)。

1.4 動(dòng)物建模與分組 Wistar大鼠90只，建模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，治療按照《國(guó)家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。腹腔注射濃度1%水合氯醛1 mL·kg-1麻醉，背部去毛后用99 ℃紗布覆蓋10 s，造成約4 cm×4 cm深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面(病理切片證實(shí))。雌雄分開后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組，每組30只。A組：凡士林紗布覆蓋。B組：0.9%氯化鈉溶液濕潤(rùn)納米銀醫(yī)用抗菌敷料覆蓋，A組、B組敷料完全覆蓋創(chuàng)面即可。C組：rhGM-CSF涂抹創(chuàng)面，每次涂抹約2 g。大鼠創(chuàng)面每天換藥，分別于傷后第1，4，7，10，14，21天留取1 cm×1 cm皮膚標(biāo)本，留取血液標(biāo)本一份，約3 mL，至第21天，終止實(shí)驗(yàn)。

1.5 創(chuàng)面病理觀察 創(chuàng)面換藥時(shí)觀察創(chuàng)面不同時(shí)間愈合情況，創(chuàng)面組織標(biāo)本在蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色下觀察創(chuàng)面上皮化程度。

1.6 EGF檢測(cè) 解凍血清標(biāo)本，按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)法測(cè)定各標(biāo)本血清中EGF水平，按照試劑盒說明書操作。

1.7 TGF-β1mRNA水平的檢測(cè) 將組織標(biāo)本按10 cm2·mL-1比例加入Trizol，用Trizol總RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度和純度，重復(fù)測(cè)定3次，A260和A280之比值應(yīng)為118～210，計(jì)算樣品總RNA 濃度。引物序列為：TGF-β1cDNA擴(kuò)增的上游引物5′-GTGGCTGAACCAA-GGAGACG-3′，下游引物5′-CGGTGTTGAGCCC-TTTCCAG-3′，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為196 bp；β-actin上游引物5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-ACTCACATCTGCTGGAAGG TGGAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度220 bp。取總RNA 1 μg，加入Oligo(dT)18 Primer，70 ℃溫育5 min；迅速放入冰浴中，加入10 mmol·L-1dNTP，RNA酶抑制劑，5×緩沖液，42 ℃溫育5 min；冰浴中加入5 U·μL-1AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，加入焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate,DEPC)處理水至總體積20 μL，42 ℃溫育60 min，70 ℃10 min，立即置冰上，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將反?yīng)管置于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀上，95 ℃預(yù)變性10 min后，進(jìn)入95 ℃變性1 min，50 ℃退火15 min，72 ℃延伸10 min 的循環(huán)，共34次，最后72 ℃充分延伸10 min。反應(yīng)完成后取PCR 反應(yīng)液10 μL，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用PCR Marker 作分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳完畢后在紫外熒光數(shù)字成像儀下觀察結(jié)果。以每例TGF-β1與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度的比值作為TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間不同時(shí)相點(diǎn)EGF、TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量采用F檢驗(yàn)，不同時(shí)相點(diǎn)組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面病理學(xué)表現(xiàn) A、B、C三組均在第10天出現(xiàn)明顯的上皮化，A組創(chuàng)面?zhèn)蠹t腫明顯，并且在第14天出現(xiàn)痂下積膿，上皮化進(jìn)程緩慢；B組創(chuàng)面?zhèn)蠹t腫，上皮化進(jìn)程較A組明顯加快；C組創(chuàng)面?zhèn)笊掀せM(jìn)程最快。傷后第14天，A組創(chuàng)面仍處于溶痂階段，炎癥反應(yīng)明顯，B組創(chuàng)面已出現(xiàn)部分上皮化，C組創(chuàng)面大部已上皮化。見圖1。

2.2 血清EGF水平 A組、B組、C組EGF水平在傷后均持續(xù)逐漸上升，A組上升速度最慢，C組上升速度最快，第1，4天各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第7天A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第7天其余各組間及第10，14，21天各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

圖1 3組大鼠燙傷后第14天創(chuàng)面上皮化情況(HE，×200)

表1 3組深Ⅱ度燙傷大鼠血液EGF水平

Tab.1 Serum EGF levels of three groups of rats with deep second-degree burn

組別第1天第4天第7天第10天第14天第21天A組0．48±0．170．48±0．130．52±0．090．59±0．100．63±0．120．72±0．14B組0．50±0．100．51±0．110．58±0．110．67±0．14?10．81±0．11?10．93±0．13?1C組0．52±0．080．54±0．120．65±0．13?1?20．78±0．12?1?20．96±0．10?1?21．18±0．16?1?2

A、B、C組間F檢驗(yàn)，第1，4天，P>0.05，第7，10，14，21天，P<0.05；兩兩比較SNK-q檢驗(yàn)，第7，10，14，21天，與A組比較，*1P<0.05，與B組比較，*2P<0.05

Ftest among group A,group B and group C at d1,d4,P>0.05,at d7, d10, d14 and d21,P<0.05; pairwise comparison by SNK-q test at d7, d10, d14 and d21;compared with group A，*1P<0.05；compared with group B，*2P<0.05

2.3 TGF-β1mRNA的表達(dá)水平 計(jì)算每例TGF-β1與β-actin條帶吸光度比值作為TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量。A組、B組TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量持續(xù)逐漸上升，而C組在第14天達(dá)到峰值，第21天下降。第1天，B組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第4天各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第7，10，14，21天各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

燙傷治療過程中創(chuàng)面治療是重要的環(huán)節(jié)，愈合過程及預(yù)后一直是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面治療過程中，可能因創(chuàng)面溶痂、感染，影響愈合，尤其是耐藥菌的廣泛出現(xiàn)，增加臨床治療的難度[1]，或是長(zhǎng)時(shí)間不愈局部纖維化形成，預(yù)后瘢痕增生及反復(fù)再發(fā)創(chuàng)面可能，因而深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面治愈的關(guān)鍵在于創(chuàng)面的上皮化進(jìn)程。

rhGM-CSF 作為組織工程產(chǎn)物，局部外用可以調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖和活化，趨化炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合[2-3]。rhGM-CSF在燒傷殘余創(chuàng)面治療上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4-5]，加速其上皮化進(jìn)程，提高創(chuàng)面的愈合率，還能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[6]，增強(qiáng)機(jī)體抵抗深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面因溶痂導(dǎo)致感染的能力，而臨床治療中多直接選擇復(fù)方環(huán)丙沙星等抗菌藥物對(duì)抗創(chuàng)面炎癥反應(yīng)[6]。燒傷創(chuàng)面存在大量基質(zhì)金屬蛋白酶，可使多種生長(zhǎng)因子降解，不利于創(chuàng)面的愈合，而納米銀具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的作用，此優(yōu)點(diǎn)促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合[7-8]。但其缺點(diǎn)是吸水性差，對(duì)創(chuàng)面的黏附性強(qiáng)給換藥工作帶來一定的困難，對(duì)促進(jìn)皮膚再生方面的作用有所欠缺。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGF水平在深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面治療過程中持續(xù)上升，與創(chuàng)面上皮化密切相關(guān)，A組水平上升最慢，上皮化速度最慢，B組水平居中，C組上升水平最快。而文獻(xiàn)研究提示，豬脫細(xì)胞真皮在深Ⅱ度燙傷治療應(yīng)用過程中，EGF水平在第3天開始上升，第5天達(dá)峰值，之后開始下降[9]。TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量，A組、B組持續(xù)上升，C組在第14天達(dá)到峰值，第21天明顯下降，TGF-β1是燙傷創(chuàng)面纖維化愈合瘢痕增生的主要作用因子，rhGM-CSF外用于創(chuàng)面，上皮化充分啟動(dòng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，同時(shí)，適度弱化TGF-β1在過度纖維瘢痕化方面的作用，減輕深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面預(yù)后瘢痕增生的可能。rhGM-CSF和納米銀均能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但是其作用機(jī)制不同，rhGM-CSF主要利用其趨化作用，活化多種促愈合細(xì)胞活性因子，如：EGF、TGF-β1、VEGF、PDGF、FGF等，加強(qiáng)趨化角質(zhì)細(xì)胞，通過刺激新生角化上皮增殖、遷移、分化和存活，參與并加速創(chuàng)面的再上皮化，納米銀主要是抑制創(chuàng)面基質(zhì)金屬蛋白酶作用，減少細(xì)胞活性因子的降解。

EGF是一種多功能的生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)、體外對(duì)多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用，提高細(xì)胞內(nèi)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，在創(chuàng)傷后上皮細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮主要作用[10]。EGF具有促進(jìn)上皮增殖、組織修復(fù)和細(xì)胞保護(hù)作用，隨著細(xì)胞外基質(zhì)的合成，上皮細(xì)胞增殖和分裂，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[11]。EGF在燒傷創(chuàng)面愈合的整個(gè)過程中均發(fā)揮重要作用，是促進(jìn)創(chuàng)面上皮化的主要作用因子之一。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：EGF在創(chuàng)面愈合中持續(xù)上升，尤其是C組，與rhGM-CSF外用活化細(xì)胞因子有關(guān)。TGF-β1相對(duì)分子質(zhì)量約25 000，是細(xì)胞生長(zhǎng)的多功能調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合。TGF-β1具有多種生物學(xué)特性，能誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞的增生并促進(jìn)其分裂成熟，對(duì)細(xì)胞增殖有雙向調(diào)節(jié)作用，在燒傷、溶痂、修復(fù)不同階段發(fā)揮著不同的生理功能[12]，細(xì)胞因子的活化能改變其水平變化，對(duì)燒傷后創(chuàng)面修復(fù)起到積極作用。隨著膠原基質(zhì)的沉積和上皮細(xì)胞再生，反饋機(jī)制通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)從而抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)smad蛋白家族的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[13]，抑制Ⅰ型膠原合成，減少成纖維細(xì)胞的過度增殖，從而在創(chuàng)面愈合的前提下抑制瘢痕的形成。本組實(shí)驗(yàn)第21天TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量下降，可能是rhGM-CSF調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)所致，提示rhGM-CSF參與組織重塑[14]。

表2 3組深Ⅱ度燙傷大鼠組織TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量

Tab.2 Relative expression of tissular TGF-β1mRNA in three groups of rats with deep second-degree burn

±s

A、B、C組間F檢驗(yàn)，第4天，P>0.05，第1，7，10，14，21天，P<0.05；兩兩比較SNK-q檢驗(yàn)，第1，7，10，14，21天，與A組比較，*1P<0.05；與B組比較，*2P<0.05

Ftest among group A,group B and group C at d4,P>0.05,at d1, d7, d10, d14 and d21,P<0.05; pairwise comparison by SNK-q test at d1,d7, d10, d14 and d21;compared with group A，*1P<0.05；compared with group B，*2P<0.05

rhGM-CSF和納米銀敷料外用均能加速深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過程的上皮化進(jìn)程[15]，但是rhGM-CSF優(yōu)勢(shì)更加明顯，能否將二者聯(lián)合應(yīng)用，充分利用凝膠保濕和納米銀敷料的敷料架構(gòu)作用，相關(guān)的系統(tǒng)性研究工作有待全面開展。

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Effect of Recombinant Human Granulocyte/macrophage Colony Stimulating Factor on Wound Healing in Rat Model of Deep Second-degree Burn

YANG Jingzhe, CHEN Fengping, FENG Xinshu, WEN Hailing, GENG Qiyin

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

Objective To study the effect of recombinant human granulocyte/macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF) on wound healing in rat model of deep second-degree burn. Methods The burn model was established with Wistar rats.They were randomly divided into three groups, petrolatum treatment group (group A,n=30), nano-silver treatment group (group B,n=30), and rhGM-CSF treatment group (group C,n=30).Pathological changes of wound of the three groups were observed on the 1st, 4th, 7th, 10th, 14th, and 21st day after treatment.Meanwhile the concentration of epidermal growth factor (EGF) in serum was measured with ELISA, and TGF-β1mRNA expression was detected by RT-PCR. Results Epithelization was observed in all the groups on the 10th day after treatment.EGF level increased gradually, and it increased most slowly in group A, and fastest in group C.There was no significant difference in EGF level among the groups on the 1st and 4th days, and between group A and B on the 7th day (P>0.05).But there was significant difference in in EGF level between group A and C, between group B and C on day 7, and among the groups on day 10, 14 and 21, respectively (P<0.05).Relative expression of TGF-β1mRNA was gradually increased in group A and group B, and peaked on day 14 and decreased on day 21 in group C.There was significant difference between group B and group C on day 1 (P<0.05), no significant difference on day 4 (P>0.05) and significant difference among the groups on day 7, 10, 14 and 21 (P<0.05). Conclusion rhGM-CSF treatment can accelerate healing of burn wound.

Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor ; Nano silver; Burn wound; Epidermal growth factor; Transforming growth factor

2014-01-21

2014-06-11

*承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20122164)；河北省2013年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃指令性課題(20130024)

楊景哲(1980-)，男，河北承德人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事燒傷創(chuàng)面愈合機(jī)制研究。電話：0314-2279277，E-mail：sanyue_1@sina.com。

陳鳳平(1970-)，并列第一作者，女，滿族，河北承德人，主管護(hù)師，學(xué)士，研究方向：深度燒傷創(chuàng)面的治療對(duì)策與護(hù)理。電話：(0)15930992842，E-mail：sanyue_1@sohu.com。

馮欣姝(1971-)，女，回族，河北承德人，副主任護(hù)師，碩士，研究方向：燒傷難愈性創(chuàng)面治療和護(hù)理。電話：0314-2279276，E-mail：sanyue_1@aliyun.com。

R965

A

1004-0781(2015)02-0153-05

DOI 10.3870/yydb.2015.02.003