陳保紅，劉軼華

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院藥劑科，漯河 462300)

羊耳菊總黃酮的大孔樹脂純化工藝優(yōu)化

陳保紅，劉軼華

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院藥劑科，漯河 462300)

目的 探討羊耳菊總黃酮的大孔樹脂純化工藝條件。方法 以靜態(tài)吸附量和解吸率為考察指標(biāo),確定最佳型號(hào)大孔樹脂, 并對(duì)其進(jìn)行羊耳菊總黃酮的的動(dòng)態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)上樣濃度、上樣速度、上樣pH、上樣量、洗脫濃度、洗脫流速、洗脫體積進(jìn)行優(yōu)化選擇。結(jié)果 最佳工藝為采用AB-8大孔樹脂；最佳動(dòng)態(tài)吸附條件為：上柱液濃度1.04 mg·mL-1，上柱流速為2 BV·h-1，pH為5.06。最佳洗脫條件為4倍體積的70%乙醇洗脫，洗脫流速控制在2 BV·h-1。結(jié)論 AB-8大孔樹脂對(duì)羊耳菊總黃酮具有良好的吸附和解吸效果。

羊耳菊；黃酮；大孔樹脂；吸附；解吸

菊科植物羊耳菊(InulacappaDC.)分布我國南方各省區(qū)，地上部分和根入藥，味辛，性平，具有祛風(fēng)痰、散熱毒作用，用于治療哮喘等[1]。主要含有黃酮類、三萜類、甾體類、糖類等成分[2]。有關(guān)羊耳菊總黃酮的提取工藝等方面報(bào)道近年來較多[3]，但對(duì)總黃酮的富集純化方面報(bào)道較少。筆者在本實(shí)驗(yàn)中主要探討大孔樹脂對(duì)羊耳菊總黃酮純化工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，AE240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，F(xiàn)D-1C-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 羊耳菊為菊科植物羊耳菊(InulacappaDC.)干燥全草，產(chǎn)自貴州六盤水，經(jīng)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系趙喜蘭副教授鑒定為菊科植物羊耳菊的干燥全草，粉碎過60目篩(篩孔內(nèi)徑0.250 mm)，備用。蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，純度>98%，批號(hào)：110752-201012)，D101、DM130、HPD300、 HPD826型大孔樹脂(滄州寶恩化工有限公司，批號(hào)：110323，100821，110112，100123)，D4020型大孔樹脂(上海試劑一廠，批號(hào)：120919)；AB-8、NKA-9型大孔樹脂(南開大學(xué)化工廠，批號(hào)：100911，110818)。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用60%乙醇溶液配制0.24 mg·mL-1蘆丁對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL于10 mL量瓶，60%乙醇溶液補(bǔ)至5 mL，加5%亞硝酸鈉(NaNO2)溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入10%硝酸鋁[Al (NO3)3]溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入4%氫氧化鈉(NaOH)溶液4 mL，60%乙醇溶液定容，搖勻，靜置20 min后，在510 nm波長處測(cè)定吸光度，蘆丁質(zhì)量濃度(C)為縱坐標(biāo)，吸光度(A)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y=1.107X-0.131，r=0.999 7。結(jié)果表明蘆丁濃度在0.012～0.096 g·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.2 黃酮粗提物的制備 取藥材100 g，以料液比1：10加入75%乙醇1 L，超聲波功率為600 W下萃取3次，每次3 h，濾過，合并，濃縮至0.5 g·mL-1原生藥，備用。

2.3 大孔樹脂的預(yù)處理 樹脂適量，95%乙醇浸泡24 h，去除雜物，濕法上柱，95%乙醇洗滌至沒有白色渾濁為止，然后純化水洗至無乙醇味為止。分別采用 5% HCl和2% NaOH 溶液以2倍樹脂床體積(The resin bed volume，BV)·h-1洗脫，共洗脫2 BV，純化水洗至中性，備用。

2.4 樹脂的篩選

2.4.1 吸附量和解析率的測(cè)定 稱取預(yù)處理的樹脂各3.0 g于100 mL錐形瓶中，精密移取黃酮粗提物20 mL(濃度1.56 mg·mL-1)，110 r·min-1震蕩24 h，吸附，過濾，測(cè)定濾液中總黃酮含量，計(jì)算各種樹脂的靜態(tài)吸附量。取吸附飽和后的樹脂置于100 mL錐形瓶，分別精密加入75%乙醇20 mL，110 r·min-1震蕩24 h，過濾，測(cè)定平衡液中總黃酮含量，計(jì)算靜態(tài)解吸率。[吸附量(mg·g-1) =(原液總黃酮含量×原液體積-吸附液總黃酮含量×吸附液體積)/樹脂質(zhì)量；解吸附量 (mg·g-1)=解析液總黃酮含量×解析液體積)/樹脂質(zhì)量；解析率(%)=解吸附量/吸附量][4]。

2.4.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定 精密稱取預(yù)處理的樹脂3.0 g于100 mL錐形瓶，精確加入樣品溶液20 mL(濃度1.56 mg·mL-1)，110 r·min-1震蕩12 h，每隔1 h吸取上清液測(cè)定總黃酮的含量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

2.5 樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸工藝參數(shù)研究 將篩選出的理想樹脂5 g濕法裝入層析柱中(徑高比1：8)，考察上柱液濃度、pH、上樣流速對(duì)吸附效果的影響以及洗脫劑濃度、體積、流速對(duì)洗脫效果的影響。

2.6 大孔樹脂的篩選

2.6.1 不同樹脂對(duì)羊耳菊總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn) 樹脂的吸附效果與樹脂極性、孔徑、比表面積存在一定的關(guān)系[5]。由表1可知，非極性 D101、D4020和弱極性AB-8的解吸附能力都較好，非極性HPD300、氫鍵HPD826吸附量較高，但是解析效率較低。因此選擇D101、D4020和AB-8進(jìn)行靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.6.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定 圖1顯示，樹脂吸附4 h后，D101、D4020、AB-8樹脂基本達(dá)到吸附平衡，屬于快速平衡型，尤以AB-8樹脂達(dá)到飽和的速度比其他樹脂快，而且吸附量大于其他型號(hào)的樹脂。

2.7 AB-8樹脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

2.7.1 上樣液濃度的影響 AB-8樹脂5 g濕法裝柱，將黃酮粗提液(1.56 mg·mL-1)加純化水稀釋成1.33，1.17，1.04，0.93，0.85，0.78，0.67，0.58 mg·mL-1的樣液各3 BV，以流速2 BV·h-1[BV·h-1指柱內(nèi)單位時(shí)間(h)流經(jīng)單位體積樹脂平均液量]、pH保存不變的條件下上樣，上樣完畢，3 BV純化水以2 BV·h-1流速過柱，收集流出液和洗脫液，測(cè)定黃酮含量，計(jì)算吸附量。結(jié)果見圖2所示，AB-8樹脂吸附量隨濃度的增大而加大，但濃度達(dá)到1.04 mg·mL-1，吸附量變化幅度不大。綜合考慮選擇1.04 mg·mL-1樣品液上樣。

2.7.2 上樣速率的考察 將3 BV樣液(1.04 mg·mL-1)分別以1，2，3，4，5 BV·h-1流速進(jìn)行上樣，上樣完畢，3 BV純化水以2 BV·h-1流速過柱，收集流出液和洗脫液，測(cè)定黃酮含量。圖3顯示，伴隨流速的增加，樹脂的吸附量在減少，流速過慢時(shí)，吸附量增加，但循環(huán)周期延長。因此，綜合考慮工作效率和吸附效果，控制流速2 BV·h-1較理想。

2.7.3 樣液的pH的確定 用稀氨水和稀鹽酸調(diào)節(jié)樣液(1.04 mg·mL-1)pH為3.07，4.06，5.06，6.07，7.08上柱，流速2 BV·h-1，上樣完畢，3 BV純化水以2 BV·h-1流速過柱，收集流出液和洗脫液，測(cè)定黃酮含量。由圖4可見，pH5.06樹脂吸附量最大，這可能是由于黃酮類化合物多為多羥基酚類化合物，呈弱酸性，因此酸性條件下吸附量最好。但如果pH過低，容易形成烊鹽，吸附效果變差。

2.7.4 上樣液體積的考察 處理好的AB-8大孔樹脂5 g濕法裝柱，樣液(濃度為1.04 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速上樣，收集流出液，每份1 BV，檢測(cè)流出液黃酮含量。由圖5結(jié)果顯示，上樣體積<3 BV時(shí)泄漏較少，>3 BV時(shí)樣液泄漏明顯，體積達(dá)10 BV時(shí)，流出液的總黃酮濃度與上樣液接近，此時(shí)樹脂已基本吸附飽和。

2.8 動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)

2.8.1 洗脫劑乙醇濃度的確定 AB-8大孔樹脂5 g濕法裝柱，取1.04 mg·mL-1樣液，以流速2 BV·h-1上樣，依次采用3 BV純化水，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇梯度以2 BV·h-1流速洗脫，收集流出液，測(cè)定黃酮含量，計(jì)算解析率。圖6顯示，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，解析率最高，可能與黃酮極性較弱相關(guān)，與70%乙醇的極性相當(dāng)。乙醇濃度過大時(shí)，雜質(zhì)容易洗脫下來。

2.8.2 洗脫劑流速的確定 AB-8大孔樹脂濕法裝柱，取樣液(濃度1.04 mg·mL-1)以流速為2 BV·h-1上樣，充分吸附，2 BV去離子水沖洗，3 BV的70%乙醇以1，2，3，4，5 BV·h-1的流速洗脫，收集流出液，測(cè)定黃酮的含量。由圖7可以看出，伴隨流速的增加，黃酮的解析率逐步減少；若流速過慢則循環(huán)周期延長，以選擇流速2 BV·h-1較理想。

表1 7種樹脂靜態(tài)吸附及解吸性能比較

圖1 樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 不同上樣液濃度的吸附量的變化曲線

圖3 不同流速的吸附量的變化曲線

圖4 不同pH的吸附量的變化曲線

圖5 不同上樣體積羊耳菊總黃酮泄漏曲線

圖6 不同乙醇濃度的解析率的變化曲線

圖7 不同洗脫劑流速的解析率的變化曲線

2.8.3 洗脫曲線 AB-8大孔樹脂濕法裝柱，取樣液(濃度1.04 mg·mL-1)以流速2 BV·h-1上樣，充分吸附，2 BV純化水洗脫，70%乙醇以2 BV·h-1流速洗脫，分段收集洗脫液，每段1 BV。圖8顯示，當(dāng)洗脫量為4 BV時(shí)，樹脂上的黃酮基本完全洗脫。故洗脫劑用量的確定為4 BV。

3 討論

7種樹脂中，AB-8大孔樹脂對(duì)羊耳菊總黃酮的吸附量和解析率較好，為快速平衡型，是純化羊耳菊總黃酮理想的樹脂。

AB-8大孔樹脂吸附羊耳菊總黃酮的最佳工藝參數(shù)：上樣藥液濃度1.04 mg·mL-1，流速為2 BV·h-1，pH為5.06。解析工藝參數(shù)：4 BV的70%乙醇濃度洗脫，洗脫流速控制在2 BV·h-1。

圖8 黃酮?jiǎng)討B(tài)洗脫曲線

羊耳菊提取液經(jīng)過AB-8大孔樹脂分離純化后，羊耳菊總黃酮總純度可以達(dá)到65.3%。

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2014-01-06

2014-02-15

陳保紅(1966-)，女，河南漯河人，副主任藥師，學(xué)士，研究方向：從事中藥活性成分的分離與鑒定。電話：(0)13721370729，E-mail：cbhonglh@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)02-0263-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.034