鄧建平,劉海燦,王 斌,董海燕,張正東,趙秀芹,李 群,萬康林

四川省川南地區(qū)結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping分型研究

鄧建平1,劉海燦2,王 斌1,董海燕2,張正東1,趙秀芹2,李 群1,萬康林2

目的 了解四川省川南地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因型構(gòu)成情況，為結(jié)核病防控提供分子流行病學(xué)依據(jù)。方法 采用間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spacer Oligonucletide typing, Spoligotyping)方法對四川省川南地區(qū)267株臨床分離菌株進(jìn)行基因分型，結(jié)果采用BioNumerics(Version 5.10)軟件進(jìn)行分析，并將Spoligotyping分型結(jié)果與SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫中的菌株進(jìn)行比對分析。結(jié)果 267株結(jié)核分枝桿菌表現(xiàn)出66種基因型，其中51株表現(xiàn)為獨(dú)特基因型，其余216株可聚為10個(gè)基因簇。與SpolDB4數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)，267株結(jié)核分枝桿菌中，144株為北京家族菌株(53.93%)，79株為T家族菌株(29.59%)，9株為H家族菌株，3株為U家族菌株，2株為MANU家族菌株，其余30株表現(xiàn)的基因型為數(shù)據(jù)庫中不存在的基因型。結(jié)論 四川省川南地區(qū)結(jié)核分枝桿菌存在較高的基因多態(tài)性，北京家族菌株和T家族菌株為主要的流行菌株，應(yīng)加強(qiáng)對這兩類菌株的流行趨勢的監(jiān)測及生物學(xué)特性研究。

結(jié)核分枝桿菌；間隔區(qū)寡核苷酸分型；北京家族

基因分型技術(shù)是結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)研究中的重要方法，在追蹤結(jié)核病的暴發(fā)流行、預(yù)測結(jié)核病的傳播模式，以及研究結(jié)核分枝桿菌菌株之間的遺傳學(xué)關(guān)系等方面具有重要的作用。Kamerbeek等提供的分析結(jié)核分枝桿菌DR區(qū)的寡核苷酸序列的分型方法(Spacer Oligonucletide typing, Spoligotyping)，是一種以PCR為基礎(chǔ)的快速分型方法[1-2]，該方法簡便，快速，能夠同時(shí)對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測和分型，并且數(shù)字化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠方便的在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行結(jié)果比較，是目前應(yīng)用最廣泛的結(jié)核分枝桿菌基因分型方法。

本研究對在四川省川南地區(qū)收集的267株結(jié)核分枝桿菌臨床菌株進(jìn)行了Spoligotyping分型研究，以初步了解該地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因型構(gòu)成以及主要流行菌株的流行程度，為該地區(qū)結(jié)核病的防治工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 本研究中的267株結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株，由四川省自貢市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所提供。結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和BCG購自中國食品藥品檢定研究院，中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 2×Taq MasterMix( 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、Biodyne C膜(Pall Biosupport公司)、streptavidin-peroxidase conjugate和CDP-star檢測液(Amersham公司)。雜交儀(MN45，Immunetics公司)、生物安全柜、PCR儀、雜交爐等儀器由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1.3 基因組DNA制備 取一菌環(huán)L-J培養(yǎng)基上生長良好的菌落，重懸于含有300 μL TE溶液的螺口管中，放入沸水浴中15 min，再12 000 r/min離心3 min；取上清液即為后續(xù)PCR過程使用的模板DNA，放-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Spoligotyping 參照Kamerbeek等研究中推薦使用的Spoligotyping 基因分型標(biāo)準(zhǔn)操作方法，對本研究中收集的267株結(jié)核分枝桿菌臨床菌株進(jìn)行分型操作[2]。實(shí)驗(yàn)過程中以H37Rv和BCG的基因組DNA作為陽性對照物，蒸餾水作為陰性對照物。

1.5 數(shù)據(jù)分析 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換為數(shù)字化結(jié)果并錄入Excel表，其中雜交結(jié)果陽性用“1”表示，陰性用“0”表示[3]。并將所有菌株的Spoligotyping 結(jié)果與SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫[4]進(jìn)行比對分析確定菌株的Spoligotyping類型，再采用BioNumerics(Version 5.10)軟件依據(jù)Spoligotyping結(jié)果用UPGMA方法對菌株進(jìn)行聚類分析[5]。

2 結(jié) 果

2.1 菌株多態(tài)性分析 根據(jù)Spoligotyping分型結(jié)果，本研究收集的267株結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株表現(xiàn)出66種Spoligotyping基因型(圖1)， 其中51株結(jié)核菌株表現(xiàn)為獨(dú)特的Spoligotyping基因型，其余的216株結(jié)核菌株可聚為10個(gè)基因簇(2～128株/簇)，菌株成簇率為77.15%。

從左至右為(1)UPGMA聚類樹，(2) Spoligotyping 指紋圖譜(3)對應(yīng)基因型的菌株數(shù)量

From left to right: 1) UPGMA dendrogram generated by Spoligotyping patterns. 2) Spoligotyping patterns. 3) Strains numbers.

圖1 267株結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping分型結(jié)果聚類圖

Fig.1 Spoligotypes of the 267M.tuberculosisstrains.

2.2 Spoligotpying分型結(jié)果 將本研究中的267株結(jié)核分枝桿菌的Spoligotyping分型結(jié)果與SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析后發(fā)現(xiàn)，共有144株結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株被鑒定為北京家族(Spoligotyping分型結(jié)果中1～34間隔區(qū)缺失，35～43九個(gè)間隔區(qū)中有3個(gè)或3個(gè)以上間隔區(qū)存在)，占全部菌株的53.93%。另外，有79株被鑒定為T家族，9株為H家族，3株為U家族，2株為MANU家族，其余30株結(jié)核菌株的Spoligotyping基因型在比對數(shù)據(jù)庫中不存在，為本研究中特異性的Spoligotyping分型結(jié)果。

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping分型方法是目前應(yīng)用最廣泛的分子分型方法之一[6-7]，并且國際上已經(jīng)建立了基于Spoligotyping的基因分型數(shù)據(jù)庫(SpolDB4.0)[4]。目前，該數(shù)據(jù)庫共包含了來自全球141個(gè)國家和地區(qū)的39 295株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTBC)菌株的Spoligotyping分型數(shù)據(jù)，可以通過將某地區(qū)獲得的Spoligotyping分型結(jié)果與該數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)比對分析，進(jìn)行樣品菌株的分型鑒定工作；同時(shí)，也可以提示地區(qū)局部的菌株流行特征。既往的結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，目前全球范圍內(nèi)的結(jié)核病流行，主要是由幾種特殊的結(jié)核分枝桿菌基因家族菌株引起的，如北京家族，T家族，H家族，CAS家族，EAI家族以及其它局部地區(qū)流行的菌株家族等。不同的基因家族菌株，具有不同的分子特征、地區(qū)性分布以及致病性，甚至在藥物敏感性方面也具有較大差異[8-10]。北京家族菌株在不同的研究報(bào)告中被發(fā)現(xiàn)分布廣泛，并被認(rèn)為可能具有更強(qiáng)的致病能力，約占全世界臨床分離菌株的13%，在亞洲遠(yuǎn)東地區(qū)更是高達(dá)50%左右[4, 11]。我國部分省、市、自治區(qū)對結(jié)核分枝桿菌北京家族基因型也進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌北京家族菌株為我國主要流行的菌株，且總體上北方省份北京家族菌株所占的比例要高于南方省份，特別是在黃河以北部分省區(qū)分離菌株中的最高占比更是可達(dá)80%以上[12-17]。另外，既往研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌北京家族基因可能具有更強(qiáng)的傳播能力和毒力，并可能與耐藥性結(jié)核病存在關(guān)聯(lián)[18]。因此研究不同地區(qū)主要流行的結(jié)核分枝桿菌的基因型構(gòu)成，特別是北京基因型菌株的流行狀況，對當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病的分子流行病學(xué)監(jiān)測和結(jié)核病防治工作都具有重要的意義。

本研究對從四川省川南地區(qū)分離收集的267株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了Spoligotyping基因分型研究。通過研究發(fā)現(xiàn)在267株結(jié)核分枝桿菌中，北京家族菌株占全部菌株的53.93%，與既往研究結(jié)果一致，即北京家族菌株仍為該地區(qū)的主要流行菌株，但卻顯著低于相鄰的西藏地區(qū)(約90%)，這可能與兩地人口構(gòu)成差異等有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌T家族菌株在本地區(qū)是流行程度僅次于北京家族菌株的一類菌株，既往的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌T家族菌株為歐美的主要流行菌株，但近年在我國其它地區(qū)進(jìn)行的研究中也發(fā)現(xiàn)了T家族菌株的流行，此家族菌株流行的具體原因仍然需要更深入的研究。此外本研究中還發(fā)現(xiàn)H家族、U家族和MANU家族菌株，及其它未在SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫中收錄Spoligotyping類型的菌株，可以發(fā)現(xiàn)本次研究中的菌株表現(xiàn)出一定的多態(tài)性。但是，由于Spoligotyping分型數(shù)據(jù)不能對北京家族菌株之間進(jìn)行有效的區(qū)分，需要引入更精確的分型方法進(jìn)行研究，以便進(jìn)行病例追蹤、復(fù)發(fā)調(diào)查等研究工作。

總之，本研究對四川省川南地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因型構(gòu)成及主要流行菌株的流行情況進(jìn)行了初步描述，發(fā)現(xiàn)北京家族菌株和T家族菌株為川南地區(qū)的主要流行菌株，在結(jié)核病的分子流行病學(xué)監(jiān)測中應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對這兩類基因家族菌株的監(jiān)測，對四川省川南地區(qū)結(jié)核病的流行趨勢分析具有重要意義。

[1]Groenen P, Bunschoten AE, Soolingen Dv, et al. Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster ofMycobacteriumtuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method[J].Mol Microbiol, 1993, 10(5): 1057-1065. DOI: 10.1111/j.1365-2958.1993.tb00976.x

[2]Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, et al. Simultaneous detection and strain differentiation ofMycobacteriumtuberculosisfor diagnosis and epidemiology[J].J Clin Microbiol,1997,35(4):907-914.

[3]Van der Zanden A, Kremer K, Schouls L, et al. Improvement of differentiation and interpretability of spoligotyping forMycobacteriumtuberculosiscomplex isolates by introduction of new spacer oligonucleotides[J].J Clin Microbiol, 2002,40(12): 4628-4639. DOI:10.1128/JCM.40.12.4628-4639.2002

[4]Brudey K, Driscoll JR, Rigouts L, et al.Mycobacteriumtuberculosiscomplex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology[J].BMC Microbiol, 2006, 6(1): 23. DOI: 10.1186/1471-2180-6-23

[5]Zhou PY, Jiang WL. Spoligotying ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin Health Lab Technol,2003,13(5): 533-535.DOI: 10.3969/j.issn.1004-8685.2003.05.001.(in chinese) 鄒佩原,蔣偉利.結(jié)核分枝桿菌的間隔寡核苷酸分型法 (Spoligotyping)[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2003,13(5): 533-535.DOI: 10.3969/j.issn.1004-8685.2003.05.001

[6]Van Soolingen D. Molecular epidemiology of tuberculosis and other mycobacterial infections: main methodologies and achievements[J].J Internal Med, 2001, 249(1): 1-26. DOI: 10.1046/j.1365-2796.2001.00772.x

[7]Sola C, Filliol I, Legrand E, et al. Genotyping of theMycobacteriumtuberculosiscomplex using MIRUs: association with VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics[J].Infect Genet Evol, 2003, 3(2): 125-133. DOI:10.1016/S1567-1348(03)00011-X

[8]Van Soolingen D, Qian L, De Haas P, et al. Predominance of a single genotype ofMycobacteriumtuberculosisin countries of east Asia[J].J Clin Microbiol, 1995, 33(12): 3234-3238.

[9]Hermans P, Van Soolingen D, Bik E, et al. Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot-spot integration region for insertion elements inMycobacteriumtuberculosiscomplex strains[J].Infect immun, 1991,59(8): 2695-2705.

[10]Streicher E, Victor T, Van Der Spuy G, et al. Spoligotype signatures in theMycobacteriumtuberculosiscomplex[J].J clin microbiol, 2007,45(1):237-240.DOI:10.1128/JCM.01429-06

[11]Glynn JR, Whiteley J, Bifani PJ, et al. Worldwide occurrence of Beijing/W strains ofMycobacteriumtuberculosis: a systematic review[J].Emerg Infect Dis, 2002. 8(8): 843-9. DOI: 10.3201/eid0808.020002

[12]Dong HY, LYU B, Zhang YY, et al. Introduction to the standard operation program of spoligotyping onMycobacteriumtuberculosisin China[J]. Chin J Epid, 2009,30(4): 384-387. DOI: 10.3760/j.issn. 0254-6450.2009.04.019(in Chinese) 董海燕,呂冰,張媛媛,等.中國結(jié)核分枝桿菌間隔區(qū)寡核苷酸分型方法標(biāo)準(zhǔn)化操作程序的探討[J].中華流行病學(xué)雜志, 2009,30(4):384-387.DOI:10.3760/j.issn. 0254-6450.2009.04.019

[13]Tong CX, Liu ZG, Ma JJ,et al. Study on genotypes of 228 clinical isolated strains ofMycobacteriumtuberculosisby spoligotyping in Gansu[J]. Pract Prev Med, 2010, 17(4): 625-628. DOI: 10.3969/j.issn.1006-3110.2010.04.001(in Chinese) 同重湘,劉志廣,馬建軍,等.甘肅省 228株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株Spoligotyping分型研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2010, 17(4): 625-628.DOI: 10.3969/j.issn.1006-3110.2010.04.001

[14]Liu FY, Liu ZG, Wang XW, et al. Genotyping study of 208Mycobacteriumtuberculosisclinical isolates from Guangxi with Spoligotyping[J].Chin J Zoonoses, 2007,23(12): 1226-1230.(in Chinese) 劉飛鷹,劉志廣,王喜文,等.Spoligotyping對廣西地區(qū)208株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的基因分型[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2007,23(12): 1226-1230.

[15]Wang XM, Liu ZG, Liu ZW, et al. Analysis on the genotyping of 70MycobacteriumTuberculosisclinical strains isolated from Zhejiang Province with spoligotyping[J].China Preventi Med,2008,9(11): 946-949. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2008.12.002(in Chinese) 王曉萌,劉志廣,柳正衛(wèi),等.70株浙江省結(jié)核分枝桿菌臨床分離株Spoligotyping基因分型研究[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2008,9(11): 946-949.DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2008.12.002

[16]Wang M, Liu ZG, Zhao XQ, et al. Genotyping in 333 strains ofMycobacteriumTuberculosisisolated from jilin province by spoligotyping technology[J].Dise Surveil,2008,23(5): 300-303.DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2008.05.015(in Chinese) 王勐,劉志廣,趙秀琴,等.間隔區(qū)寡核苷酸分型法用于 99株結(jié)核分枝桿菌杭州臨床分離株的基因分型研究[J].疾病監(jiān)測, 2008,23(5): 300-303.DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2008.05.015

[17]Yang XJ, Wan KL, Wang YH, et al. Genotyping in 333 strains ofMycobacteriumTuberculosisisolated from Jilin Province by spoligotyping technology[J]. Chin J Public Health Eng, 2009,7(6): 326-328. DOI: 10.3969/j.issn.1671-4199.2008.06.002(in Chinese) 楊修軍,萬康林,王艷華,等.應(yīng)用 Spoligotyping技術(shù)對吉林省結(jié)核分枝桿菌基因分型的研究[J].中國衛(wèi)生工程學(xué), 2009,7(6): 326-328.DOI: 10.3969/j.issn.1671-4199.2008.06.002

[18]Toungoussova OS, Sandven P, Mariandyshev AO, et al. Spread of drug-resistantMycobacteriumtuberculosisstrains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia[J].J Clin Microbiol, 2002, 40(6): 1930-1937. DOI: 10.1128/JCM.40.6.1930-1937.2002

Spoligotyping ofMycobacteriumtuberculosisin the South of Sichuan Province

DENG Jian-ping1,LIU Hai-can2,WANG Bin1,DONG Hai-yan2,ZHANG Zheng-dong1,ZHAO Xiu-qin2,LI Qun1,WAN Kang-lin2

(1.ZigongCenterforDiseaseControlandPrevention,Zigong643000,China; 2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasesPreventionandControl,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the distribution of genotypes ofMycobacterium(M.)tuberculosisin the South of Sichuan Province. And furtherly, to provide the basis on molecular epidemiology for tuberculosis (TB) prevention and control. In the year of 2010, 267 clinical isolates were genotyped by using spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping) in the South of Sichuan. After that, BioNumerics (Version 5.10) software was used to analysis the results and then compared them to the SpolDB4 database. Of the 267M.tuberculosisisolates, there were 66 genotypes. Of which 51 strains showed unique genotypes, and the remaining 216 strains were grouped into 10 gene clusters. By comparing with the SpolDB4.0 database,we found that 144 strains belonged to the Beijing family (53.93%), 79 strains were the T family (29.59%), nine H-family strains, three U-family strains, two MANU-family strains, the other 30 strains showed strange genotype that didn't exist in the SpolDB4.0 database. In the South of Sichuan,M.tuberculosishas high gene polymorphism, Beijing family and T family strains are the main epidemic strains. It’s necessary to strengthen the monitoring and biological characteristics research of the two genotypes strains.

Mycobacteriumtuberculosis; Spoligotyping; Beijing family

Wan Kang-lin,Email:wankanglin@icdc.cn; Li Qun, Email:lqzgcdc@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.006

萬康林，Email:wankanglin@icdc.cn; 李群，Email:lqzgcdc@163.com

1．四川省自貢市疾病預(yù)防控制中心，自貢 643000； 2.傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

R378.91

A

1002-2694(2015)12-1116-04

2015-07-30；

2015-11-17

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”國家科技重大專項(xiàng)“十二五”課題(No.2013ZX10003006-002)。(鄧建平和劉海燦為同等貢獻(xiàn))

Supported by the project of Chinese National Key Program of Mega Infectious Disease(No.2013ZX10003006-002)(Deng Jian-ping and Liu Hai-can contributed equally to this work).