劉 嬡，馮 將，鮮思美，劉宗勝，李鵬飛，羅代兵

羊口瘡病毒F1L和B2L基因真核表達質(zhì)粒構(gòu)建及其在MDBK細胞中的表達

劉 嬡1, 2，馮 將1, 2，鮮思美1, 2，劉宗勝3，李鵬飛1,2，羅代兵1, 2

目的 為構(gòu)建羊口瘡病毒F1L和B2L基因真核表達質(zhì)粒，同時驗證其在MDBK細胞中的表達。方法 本試驗以pVAX1為真核表達載體，在前期構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L基礎(chǔ)上，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L，對其分別進行雙酶切和測序鑒定，將鑒定正確的真核表達質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L轉(zhuǎn)染至MDBK細胞，采用RT-PCR和間接免疫熒光試驗(IFA)檢測目的基因表達。結(jié)果 雙酶切鑒定和序列測定表明真核表達質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L構(gòu)建成功，RT-PCR和IFA同時驗證目的基因在MDBK細胞漿中能瞬時表達。結(jié)論 本試驗構(gòu)建成功的真核表達質(zhì)粒為下一步羊口瘡病毒核酸疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

羊口瘡病毒；F1L基因；B2L基因；真核表達

羊口瘡(Orf)，又名羊傳染性膿皰、羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎，是由羊口瘡病毒(Orf virus，OrfV)引起的綿羊和山羊急性、高度接觸性、嗜上皮性人獸共患傳染病[1]。羊口瘡病毒為副痘病毒屬成員之一，基因組全長134～139 kb，中央編碼區(qū)(ORFs009-111)較為保守。B2L與F1L基因分別位于羊口瘡病毒第11和第59個完整開放閱讀框，高度保守，編碼42 kD和39 kD蛋白[2]。其中，42 kD蛋白是病毒核衣殼主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，可誘導機體產(chǎn)生強烈的免疫應答；39 kD蛋白是構(gòu)成病毒表面微管的主要成分之一，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體[3]。 二者均能引起機體產(chǎn)生免疫應答，同時與病毒的吸附和侵入有關(guān)，是研究較多的、具良好免疫原性的蛋白。

羊口瘡感染的典型癥狀是口、鼻、唇及外陰部皮膚出現(xiàn)菜花樣增生性損傷，也可感染齒齦、舌頭或其它部位。通常羊口瘡病毒引起羊群發(fā)病率高，致死率低，但羊口瘡病導致病羊呼吸、采食困難和繼發(fā)其他病毒或細菌混合感染，從而引起病羊死亡[4]，3～6月齡羔羊易發(fā)本病。臨床治療羊口瘡一般采用保守療法，消炎收斂，主要以抗生素控制繼發(fā)感染為主。疫苗接種為控制羊口瘡病的較為有效的手段。國外常用D1701株弱毒疫苗，國內(nèi)關(guān)于羊口瘡地方株自制滅活疫苗和弱毒苗的研究。由于羊口瘡疫苗仍處于研究階段，且需求量相對較少，國內(nèi)很難買到羊口瘡市售疫苗。此外，傳統(tǒng)疫苗可能會出現(xiàn)免疫后抗體水平不高、毒力返強等現(xiàn)象，快速高效、經(jīng)濟適用、安全方便的新型疫苗則解決這一難題。核酸疫苗是近年來研究較為多的新型疫苗。關(guān)于羊口瘡病的核酸疫苗研究較少，趙魁[5]用真核表達載體pCDNA3.1(+)成功構(gòu)建并表達了pCDNA3.1-ORFV 011(B2L)、pCDNA3.1-ORFV 059(F1L)和pCDNA3.1-ORFV 011(B2L)-linker-ORFV(F1L)疫苗質(zhì)粒；張克山[6]等用真核表達載體pVAX1取代pCDNA3.1，成功構(gòu)建了更為安全的DNA疫苗質(zhì)粒pVAX1-B2L。但采用pVAX1載體構(gòu)建OrfV B2L和F1L基因核酸疫苗未見報道。

本試驗以羊口瘡病毒B2L和F1L基因為目的基因，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pVAX1-B2L和pVAX1-F1L，二者轉(zhuǎn)染至MDBK細胞后，通過RT-PCR和IFA驗證該基因的表達，為羊口瘡病毒基因核酸疫苗及下一步雙基因核酸疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pMD18-T-F1L、pMD18-T-B2L克隆質(zhì)粒、pVAX1質(zhì)粒及OrfV 高免陽性血清由貴州大學動物疫病研究室保存；T4 DNA 連接酶、質(zhì)粒小提試劑盒、RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，脂質(zhì)體2000(Lipofatamiane 2000)購自美國Invitrogen公司；兔抗羊IgG-FITC購自北京博奧森公司。

1.2 引物設計與合成 根據(jù)本研究前期提交的OrfV-GZF1L基因(登錄號：KP057582)和B2L基因(登錄號：KP994595)，結(jié)合pVAX1真核表達載體多克隆位點，設計B2L和F1L基因特異性引物。選用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ作為酶切位點，在5′端的Hind Ⅲ酶切位點后添加Kozak序列(ACCACC)。引物由上海英濰捷基公司合成，序列見表1：

表1 加Kozak序列的F1L和B2L基因的引物序列

1.3 目的基因擴增 以pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L克隆質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，分別取模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2× PCR Mix 12.5 μL ，ddH2O補至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，54℃退火45 s，72 ℃延伸1min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取擴增產(chǎn)物10 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測。

1.4F1L和B2L基因重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 按照膠回收試劑盒說明書，分別回收純化目的片段，將F1L和B2L基因及真核表達載體pVAX1均用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ進行雙酶切，酶切體系20 μL，分別取目的基因或載體6 μL，10×buffer 2 μL，Hind Ⅲ(10 U/μL)和EcoR Ⅰ(10 U/μL)各取1 μL，ddH2O補至20 μL， 37 ℃酶切3 h。酶切后用膠回收試劑盒，分別將目的基因和pVAX1載體回收，再用T4 DNA連接酶連接，連接體系為pVAX1載體5 μL，目的DNA片段1 μL，10×Ligation Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase(5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 11.8 μL，22 ℃孵育10 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α大腸桿菌，涂布于含Kana霉素抗性LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選單菌落于含Kana霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小量提取試劑盒，提取菌液中質(zhì)粒。

1.5F1L和B2L基因重組真核質(zhì)粒的鑒定 對1.4所提的重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，同時送往上海英濰捷基公司測序。

1.6 重組質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L的轉(zhuǎn)染 使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，抽提真核表達質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX-B2L，分光光度計測定濃度及純度，選擇OD260與OD280比值在1.8～2.0之間對應的質(zhì)粒，并計算濃度。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，將真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)MDBK細胞12孔板內(nèi)。轉(zhuǎn)染前MDBK細胞約90%～100%鋪滿，空載體對照組為相同劑量的pVAX1載體，空白對照組為正常培養(yǎng)細胞。

1.7 RT-PCR檢測重組真核表達質(zhì)粒瞬時表達 轉(zhuǎn)染48 h后，使用RNA提取試劑盒提取真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組以及對照組細胞總RNA，用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用1.2 中特異性引物通過1.3中PCR方法檢測重組質(zhì)粒表達情況。

1.8 間接免疫熒光檢測真核質(zhì)粒瞬時表達 轉(zhuǎn)染48 h后，取出12孔板，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每次5 min，自然干燥后，滴加40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；滴加0.5% Trition穿透細胞15 min，PBS洗滌，5% BSA 37 ℃封閉1 h，PBS洗滌。加入1∶50倍比稀釋OrfV 高免陽性血清，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌；加入兔抗羊IgG-FITC(1∶500)，PBS洗滌3次，自然干燥后置于熒光顯微鏡下觀察。同時設正常對照組，空載體組和同形對照組。同形對照組不加陽性血清，其余步驟相同，用于觀察細胞與熒光標記抗體間的本底顯色。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴增 以構(gòu)建好的pMD18-T-F1L和pMD18-T-B2L克隆質(zhì)粒為模板分別擴增F1L和B2L基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，F(xiàn)1L基因大小約為1 029 bp，B2L基因大小約為1 137 bp，與預期片段大小相符(圖1)。

2.2 重組真核質(zhì)粒鑒定 通過HindⅢ和EcoRⅠ將構(gòu)建好的pVAX1-F1L和pVAX1-B2L分別雙酶切，可見pVAX1-F1L有一條約1 029 bp的目的條帶及約3.0 kb的空載體條帶，pVAX1-B2L有一條約1 137 bp的目的條帶及約3.0 kb的空載體條帶，與預期相符(圖2)。測序結(jié)果表示F1L和B2L基因和pVAX1載體連接正確。將雙酶切與測序結(jié)果鑒定為陽性的重組真核表達質(zhì)粒，命名為pVAX1-F1L和pVAX1-B2L。

M:DNA Marker III; 1: F1L products; 2: B2L products.

M: DNA Marker III; 1: Recombinant plasmid of pVAX1-F1L; 2: The pVAX1-F1L digested withHind Ⅲ andEcoR I;3: Recombinant plasmid of pVAX1-B2L; 4: The pVAX1-B2L digested withHindⅢ andEcoRI; 5: The non-carrier of pVAX1 vector.

圖2 pVAX1-F1L和pVAX1-B2L酶切鑒定

Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pVAX1-F1L and pVAX1-B2L

2.3 RT-PCR檢測重組真核表達質(zhì)粒瞬時表達 真核表達質(zhì)粒pVAX1-B2L和pVAX1-F1L轉(zhuǎn)染MDBK細胞48 h后，提取細胞總RNA，用F1L和B2L基因特異性引物，通過兩步法RT-PCR檢測細胞總RNA，檢測到目的基因表達(圖3)。

2.4 IFA檢測B2L和F1L基因的表達 按1.7方法進行IFA檢測，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L組轉(zhuǎn)染MDBK細胞48 h后，細胞胞漿可見綠色熒光(圖A，圖B)，同形對照組未見熒光(圖A-1，圖B-1)，pVAX1空載體組及正常細胞組未見綠色熒光(圖C，圖D)。

M: Marker D2 000; 1: MDBK cells transfected by pVAX1-F1L ; 2: MDBK cells transfected by pVAX1-B2L; 3: MDBK cells transfected by non-carrier of pVAX1 vector; 4: The normal MDBK cells.

圖3 F1L和B2L基因 mRNA的RT-PCR鑒定

Fig.3 RT-PCR identification of F1L and B2L

3 討 論

Orf具高度接觸性、傳染性、誘導繼發(fā)感染，且人獸共患[7-8]，同時OrfV能在結(jié)痂部位或環(huán)境中長期存在，重復感染同一宿主，還引起繼發(fā)感染，造成該病的防治較為困難。羊口瘡病的臨床治療采用保守療法，國內(nèi)通常是對患部進行清洗，擦涂5%碘酊、高錳酸鉀，也可灌服解毒消瘡飲[9]，或使用抗生素控制繼發(fā)感染。國外有報道一些抗病毒藥物用于羊口瘡的治療，其中西多福韋常用于多種痘病毒的治療，包含西多福韋/硫酸鋁的一種膠體噴霧治療羔羊口瘡效果較好[10-11]。疫苗接種為防控羊口瘡的有效途徑，國外研究常用D1701株弱毒活疫苗，國內(nèi)也有各地方株活疫苗或滅活疫苗研究。郭良興[12]、田婷婷[13]等制備的OrfV滅活疫苗，具較好的免疫保護力。但常規(guī)疫苗免疫后可能會出現(xiàn)抗體持續(xù)時間短、抗體水平低、毒力返強等現(xiàn)象發(fā)生，同時國內(nèi)較難買到市售羊口瘡疫苗，所以研究羊口瘡新型疫苗具有重要意義。

(A) Cells transfected by pVAX1-F1L, green fluorescence was observed; (A-1) Isotype Control of pVAX1-F1L group, no specific green fluorescence; (B) Cells transfected by pVAX1-B2L, green fluorescence was observed; (B-1) Isotype Control of pVAX1-B2L group, no specific green fluorescence; (C)The normal MDBK cells, no specific green fluorescence; (D) Cells transfected by non-carrier of pVAX1 vector, no specific green fluorescence.

圖4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDBK細胞后IFA檢測結(jié)果(400×)

Fig.4 Detection of transient expression products from recombinant plasmids in MDBK cells by IFA(400×)

新型疫苗研究中，核酸疫苗的研究較為廣泛。核酸疫苗的本質(zhì)是含有某種抗原基因的重組真核表達載體[14]，重組表達載體依靠載體本身特有的病毒啟動子和宿主的表達系統(tǒng)，從而使外源基因在細胞內(nèi)的高效表達。用于構(gòu)建核酸疫苗的真核表達載體有多種，如pHMG、pJA、pJW、pCMV、pCDNA3.1(+)、pVAX1等，帶有CMV啟動子的載體調(diào)節(jié)功能，它帶有細菌復制子(Oric)，能在大腸桿菌中高效復制。其中，pVAX1載體是用于核酸疫苗的研究中較多的載體之一，是美國FDA認可的可用于人的核酸疫苗研究的載體，其特征是攜帶強啟動子pCMV和BGH ploy A信號，允許在大腸桿菌中進行高拷貝復制和在哺乳動物細胞中高水平瞬時表達的蛋白，已在多種傳染病或寄生蟲的疫苗研究中應用。pVAX1載體是在pcDNA3.1載體的基礎(chǔ)上改造而成，該載體使用卡那霉素抗性基因替代pcDNA3.1載體的氨芐抗性基因，減少和人類基因重組的可能[15]。由于pVAX1載體是一種非融合載體，要求插入序列中5′端含一個Kozak序列、起始密碼子ATG和終止密碼子TGA/TAG/TAA，以增強目的基因表達效率[16]。杜宇[17]等的研究已證實以pVAX1載體構(gòu)建的核酸疫苗不會引起小鼠機體產(chǎn)生自身免疫性疾病的抗DNA抗體，不會導致自身免疫疾病，從而證實了pVAX1載體的安全性。本研究采用pVAX1真核表達載體構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pVAX1-B2L和pVAX1-F1L，同時B2L和F1L基因序列本身自帶起始密碼子和終止密碼子，引物設計時5′端采用Kozak序列為ACCACC，以利于B2L和F1L基因的表達。此外，由于pVAX1載體在pCDNA3.1載體基礎(chǔ)上去掉多余的序列，故在細胞中只能瞬時表達不能篩選穩(wěn)定表達的細胞系[6]。

本試驗成功構(gòu)建OrfV 真核表達質(zhì)粒pVAX-F1L和pVAX1-B2L，從mRNA水平上檢測到重組質(zhì)粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L能在MDBK細胞中轉(zhuǎn)錄，IFA結(jié)果也從蛋白水平證實了二者的表達，本試驗研究結(jié)果為羊口瘡病毒基因核酸疫苗及雙基因核酸疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

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Construction and expression of recombinant plasmids of OrfV F1L and B2L genes in MDBK cells

LIU Ai1,2,FENG Jiang1,2,XIAN Si-mei1, 2,LIU Zong-sheng3,LI Peng-fei1,2,LUO Dai-bing1, 2

(1.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandVeterinaryPublicHealthofGuizhouProvince,Guiyang550025,China; 3.InstituteofSupervisionandInspectionforAnimalProductsQualityandSafety,Bijie551700,China)

In this study, we constructed eukaryotic recombinant expression plasmids of F1L and B2L genes of Orf Virus, and identified their expression in MDBK cells. The recombinant plasmids pVAX1-B2L and pVAX1-F1L were constructed based on the pMD18-T-F1L and pMD18-T-B2L which were constructed before. Then, they were identified by digestion with restriction enzymes and sequencing. The MDBK cells were transfected with pVAX1-B2L and pVAX1-F1L plasmids coated by liposome, and the RT-PCR and indirect immunofluoresence assay (IFA) were adopted to detect the expressions of pVAX1-B2L and pVAX1-F1L. Results indicated that the recombinant plasmids pVAX1-B2L and pVAX1-F1L were constructed and confirmed successfully by sequencing and digestion, and their instantaneous expressions were verified in the cytoplasm of MDBK cells by RT-PCR and IFA. The eukaryotic recombinant expression plasmids constructed in this study would lay the foundation for the further study on nucleic acid vaccine of OrfV.

Orf viurs; F1L gene; B2L gene; eukaryotic recombinant expression

Xian Si-mei, Email: xiansimei2005@163.com.

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.008

貴州省科學技術(shù)基金項目[黔科合LH字(2014)7667]，貴州省動物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團隊(黔科合人才團隊[2015]4016)和畢節(jié)市科技局項目[畢科合字(2012)24號]。

鮮思美,Email:xiansimei2005@163.com.

1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025； 2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽 550025； 3.畢節(jié)市動物產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗所，畢節(jié) 551700

S852.65

A

1002-2694(2015)12-1124-05

2015-07-17；

2015-10-16

Supported by grants from the Science and Technology Department of Guizhou Province [Qiankehe LH (2014)7667], the Science and Technology Innovation Talents Team of Animal Disease Prevention and Control, and the Veterinary Public Health Security of Guizhou Province [Qiankehe talents team (2015)4016],and the Science and Technology Department of Bijie[Bikehe (2012)24].