徐君+劉鳳軍+張國芹+徐瑤+謝裕林+陳培峰+王建平+喬中英+黃萌+朱勇良

摘要：利用正交試驗設(shè)計，從Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物5種因素的4個水平對香稻不育系的ISSR-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，確立適合香稻的ISSR-PCR反應(yīng)體系：1.0 U Taq酶、2.5 mmol/L Mg2+、40 ng模板DNA、0.25 mmol/L dNTP、0.1 μmol/L引物濃度。進一步驗證試驗表明，在該體系下將篩選的13個ISSR引物對15個香稻不育系進行PCR擴增，均可獲得穩(wěn)定、清晰的條帶。

關(guān)鍵詞：香稻;ISSR-PCR;正交優(yōu)化

中圖分類號： S511.03 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0021-03

收稿日期：2014-05-28

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK2010207）;江蘇省蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)項目（編號：YJG0902）。

作者簡介：徐 君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士，助理研究員，研究方向為植物細胞工程。Tel：（0512）65386213;E-mail：flyforever007@163.com。

通信作者：朱勇良，副研究員，研究方向為水稻遺傳育種和生態(tài)安全標準化栽培。Tel：（0512）65386213;E-mail：thszyl@126.com。

ISSR（inter-simple sequence repeats）標記技術(shù)，是基于PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)的DNA分子標記技術(shù)，采用17～22堿基的重復(fù)錨定引物擴增重復(fù)序列之間的片段，具有重復(fù)性較好、穩(wěn)定程度高、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳作圖等研究[1]。利用ISSR標記對水稻進行遺傳分析及分類研究已有不少報道，如研究栽培稻與野生稻的親緣關(guān)系[2]、分析中國疣粒野生稻的遺傳多樣性[3]、對水稻光溫敏核不育系進行分子鑒定和遺傳分析[4]等。

江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所從事水稻育種和相關(guān)工作已有多年，在太湖地區(qū)稻資源的收集、保存、種質(zhì)鑒定及品質(zhì)改良方面進行了較多的研究和摸索工作，目前收集有各類水稻資源超過2 000份。對資源的鑒定是資源利用的基礎(chǔ)，對所收集水稻資源的遺傳多樣性進行客觀評價，可以為遺傳多樣性的保護、品種鑒定及提高育種效率提供科學(xué)依據(jù)[5]。水稻的分子標記，現(xiàn)階段以SSR（simple sequence repeats）標記為主[6-7]，但是關(guān)于更為經(jīng)濟、簡便的ISSR報道相對較少。穩(wěn)定的擴增體系是ISSR結(jié)果應(yīng)用于遺傳分析的前提[8]，由于ISSR-PCR反應(yīng)條件易受多種因素干擾，簡單的單因素不能滿足體系建立要求。本研究采用正交試驗設(shè)計，從Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物5種因素的4個水平出發(fā)，對香稻不育系ISSR反應(yīng)體系進行優(yōu)化分析，以期為今后進一步將該技術(shù)應(yīng)用于水稻育種輔助工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料是選自江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所近期選育和引進的有代表性的15個香稻不育系材料：蘇香粳1號A、太湖粳6號A、吳江3號A、9703A、軟玉A、蘇04-799A、95122A、06A、運糯6028A、揚粳9538A、皖稻68A、蘇香粳1號A（紅蓮型）、吳江3號A（紅蓮型）、太湖粳6號A（紅蓮型）、9703A（紅蓮型）。

試驗所采購的所有試劑包括：DNA Marker、PCR試劑盒、電泳相關(guān)試劑，全部購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

本試驗所用ISSR引物是參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）所設(shè)計的引物序列，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻基因組DNA提取 取0.1 g左右水稻的葉片，直接放入離心管中，置于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[9]，用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測DNA質(zhì)量，并通過紫外-可見分光光度計測定D260 nm、D280 nm，檢測DNA的質(zhì)量和濃度。將提取原液放置于-20 ℃保存。用于PCR反應(yīng)的DNA工作液進一步稀釋至100n g/μL，備用。

1.2.2 正交優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng) 采用L16（45）正交設(shè)計表，由Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物5種因素各4個水平組成，共計16個處理，正交試驗設(shè)計見表1。以水稻不育系吳江3號A（紅蓮型）DNA為模板，用ISSR引物UBC835[5′-（AC）8YT-3′]進行試驗。各處理總體積為25 μL，每個處理中均加入2.5 μL無Mg2+的10×Taq buffer，不足的體積用超純水補足，詳見表2。

PCR擴增的程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán);72 ℃延伸 5 min;4 ℃終止反應(yīng)。

將PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后于UV凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.3 ISSR引物及優(yōu)化體系驗證 根據(jù)錢韋等的報道[3-4]，篩選13個ISSR引物，對15個香稻不育系進行擴增，驗證所篩選引物對不育系的通用性及ISSR-PCR擴增體系的穩(wěn)定性。

表1 ISSR-PCR正交試驗設(shè)計表L16（45）

處理編號 Taq酶

（U） Mg2+

（mmol/L） 模板DNA

（ng） dNTPs

（mmol/L） 引物

（μmol/L）

1 0.75（1） 1.5（1） 20（1） 0.10（1） 1.0（1）

2 0.75（1） 2.0（2） 40（2） 0.15（2） 1.5（2）

3 0.75（1） 2.5（3） 60（3） 0.20（3） 2.0（3）

4 0.75（1） 3.0（4） 80（4） 0.25（4） 2.5（4）

5 1.00（2） 1.5（1） 40（2） 0.20（3） 2.5（4）

6 1.00（2） 2.0（2） 20（1） 0.25（4） 2.0（3）

7 1.00（2） 2.5（3） 80（4） 0.10（1） 1.5（2）

8 1.00（2） 3.0（4） 60（3） 0.15（2） 1.0（1）

9 1.50（3） 1.5（1） 60（3） 0.25（4） 1.5（2）

10 1.50（3） 2.0（2） 80（4） 0.20（3） 1.0（1）

11 1.50（3） 2.5（3） 20（1） 0.15（2） 2.5（4）

12 1.50（3） 3.0（4） 40（2） 0.10（1） 2.0（3）

13 2.00（4） 1.5（1） 80（4） 0.15（2） 2.0（3）

14 2.00（4） 2.0（2） 60（3） 0.10（1） 2.5（4）

15 2.00（4） 2.5（3） 40（2） 0.25（4） 1.0（1）

16 2.00（4） 3.0（4） 20（1） 0.20（3） 1.5（2）

注：括號中數(shù)字表示水平。

表2 25 μL ISSR-PCR優(yōu)化體系

試劑成分 25 μL體系

終濃度/用量 加入量

（μL）

10×Taq buffer 1× 2.5

25 mmol/L Mg2+ 2.5 mmol/L 2.5

2.5 mmol/L dNTP 0.25 mmol/L 2.5

25 μmol/L Primer 1.0 μmol/L 1.0

5 U/μL Taq Polymase 1 U 0.2

25 ng/μL模板DNA 40 ng 1.0

滅菌 ddH2O 14.3

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測

檢測同一批提取的DNA樣品結(jié)果表明，主帶明亮，略有拖尾現(xiàn)象。說明CTAB法快速提取DNA效果良好，但存在DNA降解現(xiàn)象;后續(xù)試驗表明，該法提取基因組DNA可滿足PCR試驗需求。

2.2 正交優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)

依據(jù)瓊脂糖電泳條帶的強弱和雜帶的多少做直觀分析。從圖1可以看出，在16個處理組合中，由于Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物濃度5種影響因素組合的不同，擴增效果存在著明顯差異。按照擴增結(jié)果將16個處理從高到低依次打分，條帶數(shù)量豐富、背景清晰的記為16分;與之相反，擴增結(jié)果最差的為1分。編號1-16的評分結(jié)果分別為9、8、11、10、15、14、7、6、12、13、4、3、1、2、16、5分。圖2直觀分析結(jié)果顯示，Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物濃度的最佳條件組合分別為1.0 U、2.5 mmol/L、40 ng、0.25 mmol/L、0.1 μmol/L。

2.3 ISSR引物的篩選及體系驗證

以吳江3號A基因組DNA為模板，根據(jù)文獻報道選擇13個適用于水稻的ISSR引物（引物編號、序列見表3），利用這13個引物對供試的15個香稻不育系材料進行PCR 擴增，

結(jié)果如圖3所示。可以看出，15份材料均可擴增出穩(wěn)定、清晰的條帶。試驗共擴增出89條DNA條帶，條帶大小為 160～1 600 bp，其中引物UBC809擴增出的清晰條帶最多，為12條;引物UBC807、UBC855、UBC888的擴增條帶數(shù)最少，僅有5條?？傮w看出，13個引物共產(chǎn)生25條多態(tài)性帶，引物擴增產(chǎn)物的多態(tài)性比率較低，僅為28.1%。

表3 所篩選的ISSR引物序列及擴增帶數(shù)

引物編號 引物序列 擴增帶數(shù)

（條）

UBC807 5′-（AG）8T-3′ 5

UBC808 5′-（AG）8C-3′ 7

UBC809 5′-（AG）8G-3′ 12

UBC811 5′-（GA）8C-3′ 8

UBC 835 5′-（AG）8YC-3′ 7

UBC 855 5′-（AC）8YT-3′ 5

UBC 857 5′-（AC）8YG-3′ 7

UBC 864 5′-（ATG）6-3′ 8

UBC 880 5′-GGAGAGGAGAGGAGA-3′ 7

UBC 888 5′-BDB（AC）7-3′ 5

UBC 889 5′-DBD（CA）7-3′ 6

UBC 890 5′-VHV（GT）7-3′ 6

UBC 891 5′-HVH（GT）7-3′ 6

注：Y=（C，T），B=（C，G，T），D=（A，G，T），H=（A，C，T），V=（A，C，G）。

3 結(jié)論與討論

ISSR標記基于PCR技術(shù)，較RAPD、RFLP等第一代標記穩(wěn)定，但也受多種因素影響，試驗的可靠性和穩(wěn)定性與PCR反應(yīng)條件有很大關(guān)系[10]。本試驗的目的在于建立1套成本低廉、操作簡便、可靠性高、表達穩(wěn)定的ISSR-PCR技術(shù)體系，

以期提供大量遺傳信息，應(yīng)用于香稻種質(zhì)資源的鑒定。研究中發(fā)現(xiàn)，不同反應(yīng)體系下ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果可能出現(xiàn)不同（帶型不同），該情況在李雪等的研究中也有出現(xiàn)[8，11]，分析其原因，可能是由于部分處理的引物濃度或Taq酶濃度過高而引起非特異擴增。非特異帶的形成對研究結(jié)果會造成根本性誤差，因此建立穩(wěn)定的ISSR-PCR反應(yīng)體系并對體系進行驗證就顯得更為重要[10，12]。

本試驗利用正交設(shè)計優(yōu)化，確定適用于香稻ISSR-PCR的體系為：1.0 U Taq酶，2.5 mmol/L Mg2+，40 ng模板DNA，0.25 mmol/L dNTP，引濃度0.1 μmol/L。在該體系下將所篩選13個ISSR-PCR引物對15個不育系材料進行驗證擴增，結(jié)果表明，該體系廣泛適用于各材料及所篩選的引物，且表達穩(wěn)定、條帶清晰。一般而言，13個ISSR引物擴增所獲得的信息足以進行相關(guān)遺傳分析，但筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，所篩選的13個引物雖然擴增出較多數(shù)目的分子標記（89個），但標記總體多態(tài)性較低，僅為28.1%，分析原因可能是由于香稻不育系之間來源類似、親緣關(guān)系較近。本試驗結(jié)果如果要分析香稻不育系間的遺傳關(guān)系，多態(tài)性標記數(shù)目顯得不足?？稍诒驹囼灮A(chǔ)上對香稻進行遺傳分析，進一步篩選適宜的ISSR引物以獲得更多的多態(tài)性標記，或采用分子標記結(jié)合表型標記的方法，以獲得理想的結(jié)果。

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