付婷婷，馬 寧，蒙健宗，張?jiān)崎_*

（廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004）

多糖由于其特殊結(jié)構(gòu)而具有多種不同于單糖的生化特性，如增稠、乳化、保水、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等[1-3]，被廣泛應(yīng)用于紡織、化妝品、保健品、醫(yī)藥等行業(yè)中[4-6]。目前，多糖大多是從高等植物、細(xì)菌、真菌、動(dòng)物和大型藻類中提取的，而對(duì)生長速度快、光合效率高、適應(yīng)性強(qiáng)的海洋微藻中的多糖浸提工藝和條件優(yōu)化的研究較為少見[7-8]。據(jù)報(bào)道，海洋微藻多糖成膜性能良好，具有一定保濕性，可作為功能性物質(zhì)添加于食品、化妝品中[9-10]。在免疫學(xué)研究方面，海洋微藻多糖能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖與分化、刺激巨噬細(xì)胞的吞噬、促進(jìn)細(xì)胞因子、抗體的產(chǎn)生[11]。

早期，提取多糖采用提取效率極低的水提醇沉法，后發(fā)展了酸或堿提法，而酶法、超聲波和微波輔助法，雖提取效果好，但成本高、能耗大。多數(shù)糖類物質(zhì)含有較多的極性基團(tuán)，使其易溶于稀酸、稀堿和水，但是酸性環(huán)境會(huì)使多糖中的糖苷鍵發(fā)生斷裂[12-13]，因此選擇熱堿浸提法提取微藻多糖。

在工藝優(yōu)化方面，響應(yīng)面法具有試驗(yàn)周期短、回歸方程精度高，可以研究多種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[14-16]，被廣泛應(yīng)用于微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化。因此，采用屬于響應(yīng)面法的Box-Behnken試驗(yàn)，結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)，對(duì)一株自主篩選的富含胞內(nèi)多糖的海洋綠藻，進(jìn)行胞內(nèi)多糖熱堿浸提工藝的優(yōu)化，確定最佳工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用該海洋綠藻胞內(nèi)多糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻（Chlorella vulgaris）命名為BH95：自廣西合浦紅樹林海水中分離純化。

TAP（Tris-acetate-phosphate）海水培養(yǎng)基：NH4Cl 0.375g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，CaCl2·2H2O0.05g/L，K2HPO40.108g/L，KH2PO40.054g/L，Tris2.42g/L，冰醋酸1.0mL，微量元素[17]1.0mL，滅菌海水鹽度34.47‰定容至1L，自然pH。

體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉（NaOH）及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PL303電子天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD-3/4冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；Uvmini-1240紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 小球藻的培養(yǎng)

將分離純化的單藻克隆，接種于含100 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)5 d，再以1∶10的接種量（V/V）轉(zhuǎn)接于含1 000 mL培養(yǎng)基的3 000 mL三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：生化培養(yǎng)箱溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度4 000 lx，每天光照21 h，黑暗3 h，人工搖動(dòng)3次。

擴(kuò)大培養(yǎng)10 d至穩(wěn)定期后，離心收集藻細(xì)胞，冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 小球藻多糖提取

采用熱堿浸提法提取小球藻多糖。稱取一定質(zhì)量的干燥藻粉，與1.50%的NaOH溶液按料液比1∶20（g∶mL）混合，80℃水浴2.00 h；5 000 r/min離心15 min，取上清液加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，醇沉比1∶3（V/V），4℃靜置過夜；5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，待沉淀干燥后復(fù)溶于蒸餾水中，制成小球藻粗多糖溶液。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品多糖的測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法[18-19]進(jìn)行測定，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取100 mg于105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖，溶解并用蒸餾水定容至1 000 mL，配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL溶液于干燥試管中，以蒸餾水補(bǔ)齊至1.0 mL，然后加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸進(jìn)行顯色反應(yīng)，搖勻冷卻，室溫靜置20 min，以1.0 mL的蒸餾水作為空白對(duì)照，于波長490 nm處測定其吸光度值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品中多糖質(zhì)量濃度。多糖提取率計(jì)算公式如下：

式中：Y表示胞內(nèi)多糖提取率，%；c表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的多糖質(zhì)量濃度，μg/mL；V表示提取定容后的總體積，mL；W表示干藻粉質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，分別研究提取時(shí)間（1.00 h、2.00 h、3.00 h、4.00 h、5.00 h、6.00 h、）、NaOH 質(zhì) 量 分 數(shù)（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、提取溫度（50 ℃、60 ℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（55%、65%、75%、85%、95%、100%）、醇沉比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（V/V））對(duì)海洋綠藻胞內(nèi)多糖提取率的影響。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，對(duì)提取時(shí)間（A）、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、料液比（C）、提取溫度（D）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（E）、醇沉比（F）6個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)[20]，以多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，通過Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行主效應(yīng)分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)[21]

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，各顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長及變化方向，以最快速逼近最佳區(qū)域。因素的取值根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小確定，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。找出多糖提取率最高的條件，即為響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

1.3.7 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以最陡爬坡試驗(yàn)中多糖提取率最大組作為試驗(yàn)中心點(diǎn)，各因素分別取高水平（+1）、中心點(diǎn)（0）、低水平（-1）3個(gè)水平。采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：Y=0.006 74X-0.021 35；相關(guān)系數(shù)R2=0.997 91，結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度和吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 BH95胞內(nèi)多糖提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

分別研究提取時(shí)間、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇沉比等6個(gè)因素對(duì)BH95胞內(nèi)多糖提取率的影響，各影響因素試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2A和2D可知，提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖提取率的影響趨勢相同，隨時(shí)間的延長、溫度的提高，提取率均表現(xiàn)為先上升后下降，分別在3 h、70℃時(shí)達(dá)到最大，因此，多糖提取時(shí)間選擇3 h，提取溫度選擇70℃。圖2B、2F中，在一定NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)和醇沉比范圍內(nèi)，多糖提取率均以相對(duì)穩(wěn)定的速率增加，當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過2.5%，由于堿濃度過高，多糖降解，提取率有所下降；而醇沉比達(dá)到1∶3（V/V）時(shí)，提取率開始趨于平緩，綜上分析，選擇NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，醇沉比1∶3（V/V）。圖2C中，隨著堿液加入體積的增大，提取率不斷增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25（g∶mL）后，多糖提取率有一定范圍波動(dòng)?？紤]到綜合利用和節(jié)約成本，故料液比選擇1∶25（g∶mL）。由圖2E可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在55%～75%范圍內(nèi)變化時(shí)，多糖提取率極低，且沒有明顯變化；乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，多糖提取率突然增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí)達(dá)到最大，后趨于穩(wěn)定，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%。

圖2 提取時(shí)間(A)、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、料液比(C)、提取溫度(D)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(E)和醇沉比(F)對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time(A),NaOH concentration(B),solid-liquid ratio(C),extraction temperature(D),ethanol concentration(E)and extraction solution to ethanol ratio(F)on polysaccharide extraction yield

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素設(shè)置高（+1）、低（-1）兩個(gè)水平，進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果見表3，各因素顯著性及方差分析結(jié)果見表4。

將表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。PB試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著（P＜0.05）。由效應(yīng)值可知，提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇沉比表現(xiàn)為正效應(yīng)，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。分析貢獻(xiàn)值和P值可得，A、B、D、E4個(gè)因素貢獻(xiàn)值較大且P＜0.05，其對(duì)多糖提取率貢獻(xiàn)大小依次為B＞D＞A＞E，即NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。選擇前3個(gè)為主效應(yīng)因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，以主效應(yīng)因素效應(yīng)值方向?yàn)榕榔路较?，固定其他因素料液?∶25（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、醇沉比1∶3（V/V），進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

由表5可知，第3組的多糖提取率最高，為5.31%。因此選擇第三組的水平為響應(yīng)面的中心點(diǎn)，即NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、提取溫度70℃、提取時(shí)間3.5 h。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.5.1 小球藻BH95胞內(nèi)多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定了重要影響因素的取值區(qū)間。采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6，回歸模型方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

根據(jù)表6試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用軟件Design-Expert.V8.0.6對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合并進(jìn)行方差分析，得到小球藻BH95胞內(nèi)多糖提取工藝參數(shù)回歸方程為：

Y=6.59+0.40X1+0.87X2-0.05X3-0.33X1X2-0.29X1X3-0.91X2X3-0.85X12-1.37X22-0.55X32

由表7可知，該模型的決定系數(shù)R2=0.971 4＞0.9，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為6.10%＜10%，信噪比RSN=15.380＞4.0，說明該方程相關(guān)性良好、可靠性較高、試驗(yàn)穩(wěn)定性好、試驗(yàn)操作可信。模型極顯著（P＜0.01），說明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，失擬項(xiàng)P值為0.281 3＞0.05，不顯著，表明試驗(yàn)的誤差較小，未知因素對(duì)試驗(yàn)干擾少。綜上所述，該模型能較好地對(duì)小球藻BH95胞內(nèi)多糖提取工藝參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測。

回歸模型中，因素X2、X12、X22及交互項(xiàng)X2X3影響極顯著（P＜0.01），X1、X32項(xiàng)影響顯著（P＜0.05），從F值可以看出，所選因素對(duì)多糖提取率的影響強(qiáng)弱次序?yàn)閄2＞X1＞X3，即提取溫度＞NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.5.2 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)回歸模型繪制響應(yīng)曲面圖，以確定NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響，響應(yīng)曲面圖及等高線見圖3。

三維響應(yīng)曲面圖可以表示響應(yīng)值與試驗(yàn)因素的每個(gè)水平之間的函數(shù)關(guān)系，同時(shí)可從直觀角度獲取試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)工藝參數(shù)[22]。由圖3可知，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間兩兩交互作用對(duì)多糖提取率的影響均呈拋物面型關(guān)系，且響應(yīng)面均存在一個(gè)極大值點(diǎn)。其中提取時(shí)間與提取溫度之間的交互作用最為顯著。

2.5.3 最佳提取工藝條件的預(yù)測與驗(yàn)證

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化，軟件Design-Expert.V8.0.6分析得出小球藻BH95胞內(nèi)多糖提取最佳工藝條件為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.61%、提取溫度74.5℃、提取時(shí)間3.02 h，此時(shí)多糖提取率預(yù)測值為6.85%。

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?，采用上述工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的可行性，將工藝條件修改為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.60%、提取溫度75℃、提取時(shí)間3.00 h，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到胞內(nèi)多糖提取率為6.81%，實(shí)測值與預(yù)測值的相對(duì)誤差為0.58%。試驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測值接近，表明建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)預(yù)測小球藻BH95胞內(nèi)多糖提取條件準(zhǔn)確可靠，具有一定實(shí)用價(jià)值。

圖3 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度與提取時(shí)間交互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour line of effects of interaction between NaOH concentration,extraction temperature and extraction time on polysaccharide extraction yield

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)，篩選出了對(duì)多糖提取率影響顯著的因素：即NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間，并確定最佳值區(qū)域。采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，通過Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，建立了多糖提取率與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，從而確定了BH95胞內(nèi)多糖提取的最佳工藝參數(shù)為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.60%、提取溫度75 ℃、提取時(shí)間3.00 h、料液比1∶25（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、醇沉比1∶3（V/V）。此工藝條件下，BH95胞內(nèi)多糖提取率達(dá)到6.81%。因此，將響應(yīng)面法應(yīng)用于小球藻胞內(nèi)多糖提取工藝優(yōu)化是可行的，同時(shí)為小球藻多糖及小球藻生物質(zhì)資源的應(yīng)用開發(fā)提供了一定理論參考。

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