陳志穎,王 祥,蘇 培,馮丹青,柯才煥

(廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院,福建廈門361102)

葉片山海綿共附生細(xì)菌的防污活性研究

陳志穎,王 祥,蘇 培,馮丹青*,柯才煥

(廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院,福建廈門361102)

從葉片山海綿(Mycale phyllophila)中分離純化得到7株共附生細(xì)菌,經(jīng)16S r DNA序列比對,分別歸屬于芽抱桿菌屬(Bacillus,5株)、假弧菌屬(Pseudovibrio,1株)和短桿菌屬(Brevibacterium,1株).菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后對發(fā)酵液進(jìn)行提取,以翡翠貽貝(Perna viridis)足絲分泌抑制實驗檢測提取物的防污活性.檢測結(jié)果表明,菌株NAP1和NAP7的提取物顯著抑制翡翠貽貝足絲分泌,其半抑制濃度(EC50)分別為55.26和14.85μg/m L,其余5株菌株的提取物均無防污活性.結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征和16S r DNA序列比對,將菌株NAP7初步鑒定為脫氮假弧菌(Pseudovibrio denitrificans).另外,進(jìn)一步對菌株NAP7提取物進(jìn)行活性部位追蹤,以不同極性的溶劑進(jìn)行萃取,依次獲得石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙醋相、正丁醇相和水相部分,進(jìn)行防污活性檢測,發(fā)現(xiàn)除水相部分無防污活性外,其余4個部分均顯著抑制翡翠貽貝足絲分泌,其中正丁醇相不僅防污活性高(EC50=4.06μg/m L),對翡翠貽貝的毒性也低(半致死濃度(LC50)=158.11μg/m L),表明其中含有高效低毒的活性成分.研究結(jié)果為從海洋微生物中篩選獲得新型環(huán)保海洋防污劑奠定重要基礎(chǔ).

海綿共附生細(xì)菌;防污活性;海洋防污劑;葉片山海綿

在海洋環(huán)境中,船舶、海水養(yǎng)殖網(wǎng)具及其他人工設(shè)施的表面易被海洋生物大量附著,造成生物污損問題,會導(dǎo)致船舶航行速度下降、油耗增加、堵塞網(wǎng)具網(wǎng)孔、加速金屬表面腐蝕等,對海洋運輸、海洋工程、海水養(yǎng)殖及海軍裝備都具嚴(yán)重危害[1].有機(jī)錫曾被作為海洋防污劑廣泛應(yīng)用,但因其具劇毒而被禁用.目前主要使用氧化亞銅及異噻唑啉酮、三嗪類等防污劑,但研究表明,這些防污劑對非靶標(biāo)的海洋生物具顯著的毒性作用,污染海洋環(huán)境,破壞生態(tài)平衡[2].因此,環(huán)境友好型海洋防污劑成為研發(fā)熱點.

海綿等海洋底棲生物的體表與海中非生物體的表面同樣面臨被生物污損的威脅.海洋底棲生物的體表若被污損,會妨礙其氣體和營養(yǎng)交換、阻礙生長、增加質(zhì)量、競爭食物、造成組織破損、甚至?xí)滤繹3].因此,許多海洋底棲生物在長期進(jìn)化過程中形成防污機(jī)制.其中,海洋底棲生物產(chǎn)生防污活性物質(zhì)被認(rèn)為是一種重要的防污機(jī)制[4],是發(fā)現(xiàn)環(huán)境友好型海洋防污劑先導(dǎo)化合物的潛在來源,但天然防污產(chǎn)物在生物體中的含量通常很低.有研究發(fā)現(xiàn),一些海洋底棲生物的共附生微生物也具防污活性,其作用可能是協(xié)助宿主保持體表潔凈[5-6].微生物可通過大量培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)天然產(chǎn)物,有助于解決天然產(chǎn)物防污劑在產(chǎn)量上受到限制的難題,因此其研究受到學(xué)者重視.

翡翠貽貝(Perna viridis)是一種重要的海洋污損動物,它通過分泌足絲附著在海中人工設(shè)施的表面,造成生物污損.據(jù)報道[7],翡翠貽貝在海水養(yǎng)殖網(wǎng)箱上的密度可高達(dá)5.2 kg/m2,其在養(yǎng)殖網(wǎng)箱上生長不但增加網(wǎng)箱負(fù)荷,影響網(wǎng)箱的使用壽命,還會堵塞網(wǎng)眼,影響水流通暢,造成其他養(yǎng)殖種的產(chǎn)量和品質(zhì)下降.

本文對采自廣東南澳的葉片山海綿(Mycale phyllophila)中的共附生細(xì)菌進(jìn)行分離純化,以翡翠貽貝足絲產(chǎn)生抑制實驗,檢測共附生細(xì)菌發(fā)酵液提取物的防污活性,并進(jìn)一步對所篩選出的高防污活性的發(fā)酵液提取物進(jìn)行萃取分離,追蹤其活性部位,為研發(fā)新型環(huán)保海洋防污劑提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 菌株的分離純化

海綿樣品于2013年8月采自廣東南澳,由廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院王德祥副教授鑒定為葉片山海綿.海綿采集后冷藏并迅速運回實驗室進(jìn)行菌株分離工作.在超凈臺中用無菌手術(shù)刀和鑷子將樣品切割成1 cm3大小組織塊,用無菌海水沖洗3次,以除去表面雜質(zhì)和黏附的環(huán)境微生物.然后將組織塊在無菌研缽中充分研磨至勻漿狀,轉(zhuǎn)移至50 m L離心管,加入10 m L無菌海水,渦旋震蕩混勻后,在4℃、2 500 r/min條件下離心1 min,取1 m L上清液加入含9 m L無菌海水的離心管中,進(jìn)行梯度稀釋,稀釋梯度為10ˉ1、10ˉ2和10ˉ3.吸取上述包括原液的所有梯度稀釋液100μL涂布于2216E培養(yǎng)基,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d.挑取不同形態(tài)特征的單菌落,在平板上反復(fù)劃線分離純化,獲得純培養(yǎng)物.將各菌株以20%(體積分?jǐn)?shù))甘油為保護(hù)劑,于ˉ80℃下保種.

1.2 菌株16S r DNA PCR擴(kuò)增和序列分析

采用菌落PCR手段,以通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACT-3′)[8]對所獲得細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序.所測序列上傳至NCBI進(jìn)行BLAST同源性比對分析,初步鑒定海洋微生物的歸屬.

1.3 菌株的接種發(fā)酵

將菌株接種到2216E固體培養(yǎng)基,28℃下培養(yǎng)1 d.在超凈臺中挑取單克隆菌落,接種于500 m L的2216E液體培養(yǎng)基中,于28℃、180 r/min條件下過夜培養(yǎng).所得發(fā)酵液于4℃以9 000 r/min離心20 min,獲得上清發(fā)酵液.

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物的提取

將收集到的上清發(fā)酵液用等體積的乙酸乙醋萃取3次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,獲得發(fā)酵液提取物.所有提取物4℃下保存于安培瓶中.

1.5 防污活性檢測

以翡翠貽貝足絲分泌抑制實驗檢測菌株發(fā)酵產(chǎn)物提取物的防污活性.翡翠貽貝(殼長15～20 mm)采自漳州漳浦沿岸.采集后將翡翠貽貝在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)1～2 d,使其適應(yīng)實驗室環(huán)境.實驗前,輕柔剪去翡翠貽貝的足絲,備用.實驗時,以24孔板為實驗容器,將各提取物先分別溶于二甲亞礬(DMSO)中配置成0.1,1,10 mg/m L,然后取20μL各溶液加至含1.98 m L膜濾海水的各孔中,每孔中另加入1只翡翠貽貝.以含20μL DMSO的膜濾海水(1.98 m L)為對照組, (預(yù)實驗結(jié)果表明僅含純海水的空莊組與添加DMSO的對照組間,翡翠貽貝分泌的足絲數(shù)量沒有顯著差異,可見添加20μL DMSO對翡翠貽貝足絲分泌沒有顯著影響)各實驗組均設(shè)10個平行組.24 h后觀察翡翠貽貝足絲產(chǎn)生條數(shù)和存活情況.

1.6 防污活性菌株NAP7的形態(tài)觀察和生理生化特征測定

活性檢測實驗表明在所檢測的菌株中,以菌株NAP7提取物的防污活性最高,本文對此活性菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究.將菌株NAP7接種于2216E固體培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3 d,觀察菌落形態(tài),并用掃描電鏡LEO1530觀察其菌體形態(tài)特征,同時參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]中的有關(guān)方法對其進(jìn)行生理生化特征檢測.

1.7 防污活性組分的追蹤

活性檢測實驗表明菌株NAP7發(fā)酵產(chǎn)物的提取物對翡翠貽貝的防污活性高,且無毒性作用,本文通過萃取分離對此提取物進(jìn)行防污活性部位的追蹤.將該菌株發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙醋提取物以90%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶解,用等體積的石油醚進(jìn)行萃取,石油醚萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到石油醚相部分;余下的90%甲醇部分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,用10%甲醇再次溶解,先后用等體積的二氯甲烷、乙酸乙醋和正丁醇萃取,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到二氯甲烷相、乙酸乙醋相和正丁醇相部分.余下的10%甲醇部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到水相部分.以上述翡翠貽貝足絲分泌抑制實驗檢測各部分的防污活性.

1.8 實驗數(shù)據(jù)的處理

應(yīng)用Origin Pro 9.0軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理和作圖,并采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析(one way ANOVA)比較實驗數(shù)據(jù)的顯著性差異.以史丕曼-卡伯法[10]計算所檢測物質(zhì)對翡翠貽貝足絲分泌的半抑制濃度(EC50)及半致死濃度(LC50).

2 結(jié) 果

2.1 菌株16S r DNA序列分析

從葉片山海綿中分離純化獲得7株共附生菌株,對這些菌株的16S r DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測定,并與NCBI的GenBank基因序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對,結(jié)果如表1所示.這7株菌株的16S rDNA序列均與數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的相關(guān)序列具有較高的相似性(≥99%),菌株分別屬于3個不同的屬,包括芽抱桿菌屬(Bacillus,5株)、假弧菌屬(Pseudovibrio,1株)、短桿菌屬(Brevibacterium,1株).

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物提取物的防污活性

菌株發(fā)酵產(chǎn)物提取物對翡翠貽貝的防污活性檢測結(jié)果如圖1和表2、3所示.在這7株菌株中,以菌株NAP7的提取物得率最高,為222.4 mg/L.其中,菌株NAP1和NAP7的提取物均顯著抑制翡翠貽貝足絲分泌,其EC50分別為55.26和14.85μg/m L.所檢測的其余5株菌株NAP2～NAP6的提取物在1～100 μg/m L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對翡翠貽貝足絲分泌均無顯著的抑制活性.同時,本文還觀察了在菌株發(fā)酵產(chǎn)物提取物作用下翡翠貽貝的死亡情況,檢測這些提取物的毒性作用,其結(jié)果如表2所示.這7株菌株的提取物在1～100μg/m L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對翡翠貽貝均無強烈的致死活性,LC50均大于100μg/m L.其中,菌株NAP7的發(fā)酵產(chǎn)物提取物不僅得率高,防污活性高,且實驗組中個體沒有出現(xiàn)死亡,因此本文選取對此菌株的提取物進(jìn)行進(jìn)一步的防污活性部位追蹤.

2.3 菌株NAP7的形態(tài)特征和生理生化特征

菌株NAP7在2216E固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后,菌落呈乳莊色,邊緣透明整齊,表面光滑.對菌株NAP7進(jìn)行掃描電鏡分析,如圖2所示.該菌株呈桿狀,長為1.2～2.0μm,寬為0.3～0.5μm.

菌株NAP7的生理生化特征檢測結(jié)果如表4所示.參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]和文獻(xiàn)[11],結(jié)合該菌的形態(tài)特征、生理生化特征和16S r DNA序列同源性比對結(jié)果,初步鑒定該菌為脫氮假弧菌(Pseudovibrio denitrificans).

2.4 菌株NAP7發(fā)酵產(chǎn)物提取物防污活性組分的追蹤

用不同極性的溶劑對菌株NAP7發(fā)酵產(chǎn)物提取物進(jìn)行萃取,依次獲得石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙醋相、正丁醇相和水相部分,各部分得率及防污活性和毒性檢測結(jié)果如圖3和表5、6所示.其中,水相部分對翡翠貽貝足絲分泌無顯著的抑制作用,其余4個部分均顯著抑制翡翠貽貝足絲分泌,具防污活性.相較而言,石油醚相部分的防污活性較低,其EC50為234.02μg/m L,而二氯甲烷相、乙酸乙醋相和正丁醇相部分均顯示出較高的防污活性,EC50值均在5μg/ m L以下,小于原提取物的EC50值(14.85μg/m L),表明菌株NAP7發(fā)酵產(chǎn)物中的防污活性物質(zhì)集中在這3個部分.此外,從表5和6可見,二氯甲烷相和乙酸乙醋相部分對翡翠貽貝具較高的毒性作用,其LC50值均小于5μg/m L;而正丁醇相部分對翡翠貽貝的毒性低,LC50高達(dá)158.11μg/m L.

3 討 論

海綿是天然活性物質(zhì)的豐富來源,近年研究表明,許多從海綿中分離獲得的活性化合物其真正生產(chǎn)者不是海綿,而是海綿的共附生微生物[12].目前,從海綿的共附生微生物中發(fā)現(xiàn)生物活性物質(zhì)是一個研究熱點.另一方面,海綿具固著濾食的生活習(xí)性,其體表須保持潔凈,一些共附生微生物所產(chǎn)生的活性物質(zhì)可能會為海綿起到防御體表污損的生態(tài)作用.Dash等[13-14]檢測了7株海綿共附生菌株的防污活性,發(fā)現(xiàn)有4株菌株的發(fā)酵產(chǎn)物提取物具較好的防污活性,并進(jìn)一步對其中一株活性高的菌株Winogradskyellaporiferorum的提取物進(jìn)行分離純化,獲得了聚醚類天然防污產(chǎn)物.總體上,當(dāng)前對海綿共附生微生物防污活性的研究報道還不多,但對包括海綿在內(nèi)的海洋底棲生物的共附生微生物防污活性研究已引起了相關(guān)學(xué)者的重視,近年來陸續(xù)有文獻(xiàn)報道[5].本文以一種重要的海洋污損動物翡翠貽貝的足絲分泌實驗為檢測模型,對葉片山海綿共附生細(xì)菌的防污活性進(jìn)行了研究,篩選出2株菌株NAP1和NAP7的發(fā)酵產(chǎn)物提取物具顯著的防污活性,表明這2株菌株有可能為葉片山海綿起到防污作用,另外也是發(fā)現(xiàn)環(huán)保型海洋防污劑先導(dǎo)化合物的潛在來源.

表1 分離菌株16S r DNA序列同源性比對結(jié)果Tab.1 Homology comparison of 16S r DNA sequences of the isolated strains

圖1 分離菌株發(fā)酵液提取物對翡翠貽貝足絲分泌的影響Fig.1 Effects of extracts from fermentation broth of the isolated bacteria on byssus thread production of P.viridis

表2 分離菌株發(fā)酵液提取物對翡翠貽貝存活的影響Tab.2 Effects of extracts from fermentation broth of the isolated bacteria on survival of P.viridis

表3 分離菌株發(fā)酵液提取物的得率及其對翡翠貽貝的防污活性和毒性Tab.3 Yield,antifouling activity and toxicity of extracts from fermentation broth of the isolated bacteria against P.viridis

圖2 菌株NAP7掃描電鏡圖Fig.2 The SEM picture of the strain NAP7

表4 菌株NAP7的生理生化特征Tab.4 Physiological and biochemical characteristics of the strain NAP7

本文還對防污活性較高的菌株NAP7的提取物進(jìn)行了活性部位追蹤,發(fā)現(xiàn)除了水相無防污效果外,石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙醋相和正丁醇相均具防污活性,表明菌株NAP7中可能含有不止一種天然防污活性物質(zhì),且活性物質(zhì)為中低極性物質(zhì).此外,本文還發(fā)現(xiàn)該菌株提取物的二氯甲烷相、乙酸乙醋相和正丁醇相具高防污活性,EC50值小于5μg/m L,有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用潛力.尤其是正丁醇相不僅防污活性高,毒性也低,表明其中含有高效低毒的活性成分.作者嘗試以GC-MS方法對菌株NAP7的提取物進(jìn)行初步分析,發(fā)現(xiàn)可能含有硅氧烷類、呋喃醇、生物堿類和甾醇類化合物.下一步將應(yīng)用色譜分離純化方法從菌株NAP7中篩選防污活性化合物.

圖3 菌株NAP7提取物不同極性部分對翡翠貽貝足絲分泌的影響Fig.3 Effects of fractions with different polarity from the extract of the strain NAP7 on byssus thread production of P.viridis

表5 菌株NAP7提取物不同極性部分對翡翠貽貝存活的影響Tab.5 Effects of fractions with different polarity from the extract of the strain NAP7 on survival of P.viridis

表6 菌株NAP7提取物不同極性部分的得率及其對翡翠貽貝的防污活性和毒性Tab.6 Yield,antifouling activity and toxicity of fractions with different polarity from the extract ofthe strain NAP7 against P.viridis

結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征和16S r DNA序列比對,將菌株NAP7初步鑒定為脫氮假弧菌.有學(xué)者在其他海綿種類中也曾分離出與脫氮假弧菌有較高同源性的菌株,且發(fā)現(xiàn)其具抗菌活性[15-16].另外,在軟珊瑚Sarcophyton sp.共附生微生物中也發(fā)現(xiàn)了與脫氮假弧菌有較高同源性的菌株,具抑制海洋污損細(xì)菌生長的活性[17].本文則檢測出菌株NAP7對翡翠貽貝足絲分泌具顯著的抑制活性.在接下來的工作中可檢測該菌株對其他污損生物的附著是否也具抑制作用,觀察其是否具廣譜防污活性.

傳統(tǒng)的有機(jī)錫和氧化亞銅等重金屬防污劑不僅對生物有毒性作用,且在環(huán)境中難降解,而天然防污活性物質(zhì)具生物可降解性,有利于保持生態(tài)平衡,可望替代對環(huán)境有害的防污劑,是獲得新型環(huán)保防污劑的重要來源.目前,天然防污活性物質(zhì)的主要篩選生物源包括海洋底棲無脊椎動物[18-19]、海洋藻類[20]和海洋微生物[21].與前兩者相比,微生物可通過發(fā)酵工程技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)活性物質(zhì),因此防污活性功能菌株在海洋環(huán)保防污技術(shù)領(lǐng)域具較大的開發(fā)利用潛力,值得深入研究.

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Study on Antifouling Activity of Bacteria Associated with Marine Sponge Mycale phyllophila

CHEN Zhi-ying,WANG Xiang,SU Pei,FENG Dan-qing*,KE Cai-huan
(College of Ocean&Earth Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

:Seven bacterial strains were isolated from marine sponge Mycale phyllophila.Based on comparative analysis of their 16S r DNA sequences,five strains were affiliated to the genus Bacillus,one to the genus Pseudovibrio,and one to the genus Brevibacterium.And then,they were subjected to fermentation and the extracts of culture broth were tested for antifouling activity using the bioassay of byssus thread production with the green mussel Perna viridis.The results showed that the extracts of the bacterial strains NAP1 and NAP7 significantly inhibited byssus thread production of P.viridis,with EC50of 55.26 and 14.85μg/m L,respectively. The extracts of the other five strains had no antifouling activity.Additionally,the extract of the strain NAP7 were further investigated for its active fraction.It was separated with solvents of different polarities.Petroleum ether fraction,methylene dichloride fraction,ethyl acetate fraction,n-butanol fraction and water fraction were obtained successively and then tested for antifouling activity. Although there was no antifouling activity in the water extract,the other four fractions significantly inhibited byssus thread production of P.viridis.Especially,the n-butanol fraction was highly antifouling active(EC50=4.06μg/m L)and not very toxic(LC50= 158.11μg/m L),indicating that this fraction contained substance(s)with high antifouling activity and low toxicity.The findings of this study are important for screening environmentally friendly marine antifoulants from marine microorganisms.

sponge-associated bacteria;antifouling activity;marine antifoulants;Mycale phyllophila

P 745

A

0438-0479(2015)03-0340-07

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.03.008

2014-10-22 錄用日期:2015-01-20

國家自然科學(xué)基金(41106121);海洋公益性行業(yè)科研專項(201305016);廈門市海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范重點項目(12PZB001SF09);廈門大學(xué)海洋科學(xué)基地科研訓(xùn)練及科研能力提高項目(J1210050)

*通信作者:dqfeng@xmu.edu.cn

陳志穎,王祥,蘇培,等.葉片山海綿共附生細(xì)菌的防污活性研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2015,54(3): 340-346.

:Chen Zhiying,Wang Xiang,Su Pei,et al.Study on antifouling activity of bacteria associated with marine sponge Mycale phyllophila[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(3):340-346.(in Chinese)