單 濤，鄭 波，陳 熹，吳 濤，季爾麗，白育花，王繼欣，肖小玲

（西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院：1.普通外科；2.手術室，陜西西安 710004）

◇臨床研究◇

AQP5在結直腸癌中的表達及其與臨床預后的關系

單 濤1，鄭 波1，陳 熹1，吳 濤1，季爾麗1，白育花1，王繼欣1，肖小玲2

（西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院：1.普通外科；2.手術室，陜西西安 710004）

目的探討水通道蛋白5（AQP5）的表達與結直腸癌臨床病理及預后關系。方法收集術前未予任何治療的臨床病例資料齊全的原發(fā)性結直腸癌病例45例，采用免疫組化法檢測AQP5的表達。比較AQP5表達與年齡、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤部位、淋巴結、病理類型之間的關系，并結合隨訪資料分析AQP5表達與否和預后的關系。結果45個腫瘤標本中，14例（31.1%）高表達AQP5，29例（64.4%）中度表達，2例（4.4%）無AQP5染色。癌旁和正常組織中AQP5表達率分別為3例（6.67%）和3例（6.67%）。AQP5的表達還與TNM分期（P=0.002）、淋巴結轉(zhuǎn)移（P=0.016）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.000）呈正相關。在年齡、性別、組織學分級和腫瘤大小中其表達沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結論AQP5可能被用作預測結直腸癌預后的良好指標。

結直腸癌；水通道蛋白5（AQP5）；預后

目前，結直腸癌仍是腫瘤相關死亡的第二大常見原因［1］。盡管在診斷和治療中取得一定進展，結直腸癌仍嚴重影響生命健康［2］。因此，尋找干預治療的新靶向非常重要。

近年來，越來越多的研究表明，腫瘤的生長、進展、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤微環(huán)境和腫瘤代謝［3］。水分子在腫瘤的進展中發(fā)揮顯著的作用，這一認識對于制訂抗腫瘤治療方案非常重要［4］。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是具有分泌和吸收功能的上皮細胞運輸水的一類水膜通道，某些亞型也參與其他分子的運輸，如甘油和尿素。目前，在哺乳動物中有13種AQP成員，其中，AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6、AQP8主要是水選擇性，而AQP3、AQP7、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12也可以輸送甘油和其他小分子溶質(zhì)［5］。AQPs基于其特定的組織定位在幾種類型腫瘤中表達有所不同，AQP1的表達通常與腦腫瘤相關［6］。王璐等［7］研究發(fā)現(xiàn)，AQP3表達與皮膚鱗狀細胞癌的分化程度相關，在AQP3敲除小鼠的研究中，AQP3基因缺失誘導對致癌物誘導的皮膚腫瘤的抵抗。通過AQP3進行的甘油轉(zhuǎn)運有助于細胞增殖和腫瘤發(fā)生中ATP（adenosine triphosphate）的生成［8］。AQP5可能參與細胞增殖而廣泛過表達于胰腺癌中［9］。

AQP5在結腸癌組織中的表達與腫瘤轉(zhuǎn)移有關，這表明，AQP5過表達在腫瘤進展中發(fā)揮一定作用［10］。有資料提出RAS信號轉(zhuǎn)導可以提高AQP5過表達的NIH3T3細胞增殖［11］。此外，一項分子研究發(fā)現(xiàn)，AQP5與SH3結構域c-Src蛋白結合，這一蛋白是與各種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移表型相關的非受體胞質(zhì)酪氨酸激酶［12］。然而，AQP5在結直腸癌中的表達和臨床意義尚未完全闡明。為了評估AQP5作為結直腸癌的一種新型預后標志物的潛力，我們使用免疫組織化學方法檢測結直腸癌臨床樣本中AQP5的表達，進一步分析AQP5的表達與結直腸癌臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料選取西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院普外科2012年1月至2013年12月的45例結直腸癌患（結腸25例，直腸20例）者的腫瘤組織，40 m L/L的甲醛固定。其中，男性24例，女性21例，手術時的中位年齡為58.3歲（40～78歲）。樣本的組織學類型均為結直腸腺癌，腫瘤分期和組織學分級均根據(jù)國際抗癌協(xié)會的分類記錄。45例標本中，Ⅰ期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期27例、Ⅳ期4例。病理分級如下：7例Ⅰ級、20例Ⅱ級、18例Ⅲ級。對所有的患者進行隨訪，隨訪中位時間為23個月（5～53個月）。所有的研究均經(jīng)西安交通大學人體試驗委員會批準，受試人員均簽署由中國西安交通大學人體試驗會員會倫理審查委員會批準的知情同意書。

1.2 免疫組化檢測AQP5蛋白的免疫組化采用標準化的鏈霉親和過氧化物酶的方法，組織切片（4μm）在適當濃度的一抗中孵育過夜，次日，切片在生物素標記的羊抗兔IgG中孵育30 min，隨后在過氧化酶標記的鏈霉親和素室溫孵育20 min。用0.2 g/L的3，3′-二氨基聯(lián)苯胺在50 mmol/L Tris-HCL緩沖液（p H 7.6）中染色5～7 min，經(jīng)蘇木精復染、水沖洗、脫水、清除、封片。免疫染色的陰性對照用非免疫山羊或兔血清替代一抗，顯微鏡觀察，抗AQP5和βactin抗體購自美國Santa Cruz生物公司。

1.3 結果判斷標準使用DA KO Hercept Test評分方法：（-）無細胞染色或少于30%的腫瘤細胞細胞膜（質(zhì)）較弱染色；（+）大于30%的腫瘤細胞細胞膜（質(zhì)）部分較弱染色；（■）大于30%的腫瘤細胞細胞膜（質(zhì)）完全較弱到中等染色；（■）大于30%的腫瘤細胞細胞膜完全強染色。（-）和（+）的判為AQP5表達陰性，而評分為（■）和（■）的判為AQP5表達陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析采用χ2檢驗或雙側(cè)Fisher精確檢驗分析方法。Pearson相關系數(shù)用來衡量關聯(lián)強度。采用Kaplan-meier計算生存率、Log-rank檢驗進行差異性檢驗。選擇有顯著性的因素逐步建立Cox多元比例風險模型，以確定其預后價值。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。所有的統(tǒng)計學分析采用SPSS13（SPSS，Chicago）軟件。

2 結 果

2.1 結直腸癌中AQP5蛋白的表達為確定AQP5在結直腸癌中的表達狀態(tài)，首先用免疫組化評估結直腸癌患者的腫瘤標本、癌旁組織和正常組織。研究結果顯示，AQP5在病例組中14/45（31.1%）強表達，29/45（64.4%）中度表達，僅偶爾在癌旁組織［（3/ 45），6.67%］和正常組織［（3/45），6.67%］中檢測到（圖1）。

2.2 AQP5表達與臨床病理特征之間的關系AQP5蛋白表達和臨床病理間的關系總結如下：AQP5在Ⅰ～Ⅱ期病例［7.1%（1/14）］中強表達，顯著低于Ⅲ期［33.3%（9/27）］和Ⅳ期［100%（4/4）］中的表達水平（P=0.002），與淋巴結（P=0.016）和遠處轉(zhuǎn)移（P=0.000）呈正相關，與年齡（P=0.848）、性別（P=1.000）、組織學分級（P=0.913）和腫瘤大小（P=0.263）差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

圖1 結直腸癌、癌旁和正常組織中AQP5的表達水平Fig.1 Expression of AQP5 in colorectal cancer，para-neoplastic and normal tissues（×400）

表1 結直腸癌組織中AQP5表達與臨床病理因素的關系Tab.1 Association between AQP5 expression and clinicopathologic factors in colorectal cancer

2.3 AQP5與結直腸癌預后的關系為了確定AQP5與結直腸癌預后的關系，我們對基于AQP5表達狀態(tài)的患者累積生存率進行了分析（圖2）。將AQP5弱染色和無染色定為陰性，強染色定為陽性。AQP5陰性患者（n=31）3年累積生存率為24.3%（中位時間，21.2個月）；相反地，AQP5陽性患者（n=14）的累積生存率為7.4%（中位時間，7.7個月），有統(tǒng)計學差異（P=0.011）。

圖2 結直腸癌組織中AQP5表達陽性組和陰性組的生存曲線圖Fig.2 The postoperative survival curves of colorectal cancer patients with positive or negative AQP5 expression

多因素分析顯示，淋巴結轉(zhuǎn)移（P=0.018）和TNM分期（P=0.031）是結直腸癌患者總生存期的獨立預后因素；腫瘤大小等其他臨床參數(shù)不是獨立的預后因素（表2）。

表2 Cox多元比例風險預后模型Tab.2 Prognostic factors in Cox multivariate analyses

3 討 論

AQPs是廣泛存在于原核和真核生物細胞膜、高效選擇性轉(zhuǎn)運水分子的特異通道。腫瘤是機體在各種致瘤因素的作用下，細胞在基因水平上失去其生長的正常調(diào)控，導致新生物生成的過程。腫瘤所依賴的各種代謝都需要水分子的參與，而水通道蛋白可以快速特異的轉(zhuǎn)運水分子。到目前為止，在哺乳動物中有13種AQP成員，其中，AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6、AQP8主要是水選擇性，而AQP3、AQP7、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12也可以輸送甘油和其他小分子溶質(zhì)［5］。它參與腎臟對水的重吸收、腺體的分泌、小腸脂肪吸收，參與氣血屏障［13］、血腦屏障、腦脊液形成，參與應激反應、組織損傷、感染及腫瘤形成過程等。AQPs基于其特定的組織定位在幾種類型腫瘤中表達有所不同，AQP1的表達通常與腦腫瘤相關［6］。在AQP3敲除小鼠的研究中，AQP3基因缺失可以誘導致癌物所致的皮膚腫瘤的抵抗。通過AQP3進行的甘油轉(zhuǎn)運有助于細胞增殖和腫瘤發(fā)生中ATP的生成［8］。AQP5可能參與細胞增殖而廣泛過表達于胰腺癌中［9］。本研究結果顯示，與癌旁組織和正常組織相比，結直腸腫瘤中AQP5表達上調(diào)。此外，AQP5與高TNM分期和不良預后密切相關。顯然，AQP5過表達的患者被證實更易轉(zhuǎn)移。這些研究結果擴展了我們對AQP5作為診斷指標意義的理解。

水通道蛋白在維持水平衡和調(diào)節(jié)多種病理生理過程中發(fā)揮關鍵的作用［14］。AQP5，21～24ku蛋白，最初被認為是位于細胞膜小窩的主要結構蛋白、參與致癌轉(zhuǎn)化和惡性進展的關鍵分子［15-16］。AQP5促進腫瘤進展具體作用機制還不完全明確。有研究認為AQP5可能通過促血管生成機制起作用［17］：其一，新生血管可以提供營養(yǎng)和氧氣；其二，新生血管內(nèi)皮細胞可以分泌多種多肽生長因子促進腫瘤生長。研究發(fā)現(xiàn)［18］AQP1表達于腫瘤新生血管并且可促進腫瘤血管生成。另外，細胞凋亡是在各種生理或病理因素的作用下，由基因控制的細胞自主有序的死亡，是機體為適應生存環(huán)境而主動自殺的過程。AQP8和AQP9表達于正常肝臟。AQP8主要定位于細胞內(nèi)，而AQP9主要定位于細胞膜，肝癌細胞上AQP8和AQP9表達下降。并且這些細胞對滲透壓和凋亡刺激的反應性下降。肝癌細胞對凋亡刺激的反應減少，則腫瘤細胞死亡數(shù)量減少，意味著腫瘤生長分數(shù)與丟失分數(shù)之比增加，腫瘤可以不斷長大。上述的AQP5改變腫瘤生物學行為可能是在幾條導致細胞轉(zhuǎn)化的信號通路中起調(diào)節(jié)作用，包括由Src家族酪氨酸激酶、表皮生長因子受體、Wnt信號和Erk1/2介導的信號轉(zhuǎn)導［11，17-18］。最近，LEE等［12］報道，AQP5與乳腺癌患者淋巴結轉(zhuǎn)移和不良預后顯著相關，提示AQP5作為乳腺癌預后指標的價值。HUANG等［19］證實，AQP5促進胃癌細胞增殖、遷移。王巍等［20］進行的一項研究表明，AQP5主要表達于結直腸癌細胞，在癌旁組織中幾乎不表達。結直腸癌中AQP5的臨床意義尚未有定論。我們的研究結果表明，AQP5主要表達于結直腸癌細胞中，在癌旁組織和正常組織中呈低表達。本研究中檢測到的結直腸組織中AQP5表達譜與以前研究結果相一致。此外，我們分析了AQP5與結直腸癌臨床病理特征的相關性，結果表明，AQP5與患者的年齡、性別無顯著性相關性，而與腫瘤分化、TNM分期和遠處淋巴結轉(zhuǎn)移相關。本研究初步證實了AQP5在結直腸癌中可能的作用部位，具體AQP5通過何種機制影響結直腸癌進展，有必要在細胞分子生物學及動物實驗中進一步探討，這也是本課題組下一步的方向。

總之，本階段研究提示AQP5蛋白在結直腸癌中表達上調(diào)，與高TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移和不良預后緊密相關。因此，AQP5可作為結直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的新的生物標志物。

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（編輯 韓維棟）

Expression of AQP5 in colorectal cancer and its relationship with clinical outcome

SHAN Tao1，ZHENG Bo1，CHEN Xi1，WU Tao1，JI Er-li1，BAI Yu-hua1，WANG Ji-xin1，XIAO Xiao-ling2
（1.Department of General Surgery；2.Operation Room，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710004，China）

ObjectiveTo determine the relationship of the expression of aquaporin 5（AQP5）with clinicopathology and prognosis of colorectal cancer.MethodsWe collected data from 45 patients with primary colorectal cancer without any adjuvant therapy before operation.The expression of AQP5 was measured by immunohistochemistry（IHC）.Then we analyzed the correlation between AQP5 expression and clinicopathological parameters（including age，tumor size，clinical staging，tumor location，lymph node and pathological type）and the connection between AQP5 expression and prognosis based on follow-up data.ResultsOf the 45 tumor specimens，14（31.1%）had a high level of AQP5 expression，29（64.4%）exhibited a moderate level of staining，and 2（4.4%）had an absence of AQP5 staining.AQP5 was only occasionally detected in para-neoplastic［3/45（6.67%）］and normal tissues［3/45（6.67%）］.The overexpression of AQP5 was also positively associated with TNM stage（P=0.002），lymph node metastasis（P=0.016），and distant metastasis（P=0.000）.However，it had no significant association with age，gender，histologic grade or tumor size（P＞0.05）.ConclusionAQP5 may be used as a novel biomarker for predicting the prognosis of colorectal cancer.

colorectal cancer；aquaporin 5（AQP5）；prognosis

R735.3

A

10.7652/jdyxb201506020

2015-03-03

2015-04-10

國家自然科學基金資助項目（No.81402583）；陜西省自然科學基金資助項目（No.2014JQ4165）

Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81402583）and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province（No.2014JQ4165）

陳熹.E-mail：Chenxi@163.com.鄭波同為第一作者.

優(yōu)先出版：http：//w ww.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150928.1505.006.html（2015-09-28）