李云肖，殷芳圓，喬曉孟，魏曙光，賴江華

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061）

◇臨床研究◇

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因單核苷酸多態(tài)性與陜西漢族海洛因依賴群體的相關(guān)性研究

李云肖，殷芳圓，喬曉孟，魏曙光，賴江華

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061）

目的探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）基因多態(tài)性與海洛因依賴的相關(guān)性。方法對符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的海洛因依賴組308例及健康對照組317例進(jìn)行臨床資料收集與血樣采集。采用飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法對BDNF rs16917204、rs6265、rs7103873、rs7103873、rs56164415、rs13306221、rs2030323共7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和HaploView 4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果rs6265位點(diǎn)基因型頻率分布在海洛因依賴組及健康對照組中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=15.151，P=0.001）。與健康對照組相比，海洛因依賴組rs6265位點(diǎn)G等位基因頻率顯著高于健康對照組（χ2=9.864，P=0.002，OR=1.429，95%CI=1.143～1.786）。rs13306221位點(diǎn)基因型頻率分布在海洛因依賴組及健康對照組中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=7.699，P=0.006）。與健康對照組相比，海洛因依賴組G等位基因頻率顯著高于健康對照組（χ2=7.137，P=0.008，OR=0.539，95%CI=0.340～0.853）。連鎖不平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由rs6265與rs71038731（block1）構(gòu)建的單倍型為強(qiáng)連鎖不平衡（D’＞0.9；r2＞0.8）。在海洛因依賴組及健康對照組中，G-G單倍型頻率分布存在顯著性差異，健康對照組中G-G單倍型頻率顯著高于海洛因依賴組（χ2= 4.546，P=0.033）。結(jié)論BDNF基因rs6265及rs13306221多態(tài)性位點(diǎn)可能與海洛因依賴有關(guān)，攜帶有rs6265位點(diǎn)G等位基因及rs13306221位點(diǎn)G等位基因的個(gè)體更易形成海洛因依賴，攜帶有G-G單倍型（rs6265-rs71038731）的個(gè)體相對不易對海洛因產(chǎn)生依賴。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）；海洛因依賴；單核苷酸多態(tài)性

毒品依賴是一種慢性復(fù)發(fā)性腦病，主要特征為渴求用藥、戒斷綜合征、復(fù)發(fā)性、耐受性以及對藥物產(chǎn)生敏化。目前，海洛因仍為我國主要濫用毒品之一，給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對海洛因依賴病因的研究具有重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)意義。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotophic factor，BDNF）是腦內(nèi)含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，參與5-羥色胺和多巴胺能等多種神經(jīng)元的生長、分化及損傷后修復(fù)［1-2］，而多巴胺邊緣系統(tǒng)在藥物依賴中有重要作用。因此，BDNF在藥物依賴的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。

BDNF基因位于11號(hào)染色體上，長67.17 kb，包含11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子。在BDNF基因和藥物依賴的關(guān)聯(lián)性研究中，關(guān)于基因多態(tài)性的研究結(jié)果并不一致。HAERIAN等［3］對BDNF基因與酒精、尼古丁、海洛因及甲基苯丙胺依賴的關(guān)聯(lián)性研究進(jìn)行了系統(tǒng)回顧及Meta分析，發(fā)現(xiàn)rs6265位點(diǎn)的G等位基因是南亞人群或中國人群海洛因及甲基苯丙胺依賴患者的危險(xiǎn)等位基因。而MENG等［4］的研究結(jié)果表明，中國人群BDNF基因3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（rs10835210、rs16917234、rs6265）與藥物依賴無顯著性相關(guān)。此外，既往研究的樣本量較小，如MARK等［5］研究的BDNF多態(tài)性與海洛因依賴關(guān)聯(lián)分析中，海洛因依賴患者樣本數(shù)為128個(gè)，CHENG等［6］的海洛因患者樣本數(shù)為200個(gè)，KANAKO等［7］研究的甲基苯丙胺依賴患者數(shù)量為189個(gè)。

綜上所述，BDNF基因?qū)Ｂ逡蛞蕾嚲哂兄匾饔?，然而既往研究位點(diǎn)少，無法捕獲全部有意義的單核苷酸多態(tài)性（SNP），且多態(tài)性研究結(jié)果矛盾。因此，對BDNF基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)篩選，進(jìn)而對中國海洛因依賴人群進(jìn)行相關(guān)性研究具有重要意義。我們所選的7個(gè)SNPs中，rs13306221、rs6265可能與物質(zhì)依賴有關(guān)［8］，rs56164415可能影響B(tài)DNF表達(dá)，rs16917237、rs16917204可能與精神性疾病有關(guān)［9］，rs2030323可能與人性特征有關(guān)［10］，rs16917204-rs6265-rs7103873處于連鎖不平衡狀態(tài)［11］。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2007至2010年就診于陜西精神衛(wèi)生中心美沙酮門診的海洛因依賴患者308例作為海洛因依賴組，平均年齡為（39.6±6.2）歲，均為男性。阿片類藥物成癮診斷是按照美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊第4版（DSM-IV）的診斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合尿檢及病史綜合判斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：大于等于18周歲；陜西漢族人；無親緣關(guān)系；在西安精神衛(wèi)生中心接受美沙酮維持治療（MMT）至少半年；每天或幾乎每天使用海洛因至少1年；在每年維護(hù)治療之前，精神科醫(yī)生要重新評(píng)估主要的精神和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。病史采集包括：①使用海洛因的始發(fā)年齡和使用的持續(xù)時(shí)間；②海洛因使用劑量；③海洛因使用方式（鼻吸或注射）；④是否有其他物質(zhì)依賴；⑤是否伴隨其他精神性疾病。排除以下情況：有安非他明、巴比妥類藥物、苯二氮卓類藥物、大麻或其他可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物使用史；酒精和尼古丁依賴史；有嚴(yán)重的軀體疾病、遺傳性疾病、可能影響血液系統(tǒng)的疾病。

從西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院健康體檢中心選取317例健康體檢者作為對照組，均為陜西漢族男性，平均年齡（40.2±5.8）歲。收集其他藥物使用史。排除有物質(zhì)濫用史，參加其他研究或慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者。

1.2 方法EDTA抗凝真空采血管收集外周血3～5 m L，采用TIANamp Blood DNA Kit全血基因組DNA提取試劑盒（天根，中國北京）提取基因組DNA，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。SNP分型由上海邃志生物科技有限公司利用美國Sequenom公司的Mass ARRAY系統(tǒng)完成，該系統(tǒng)是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF）。PCR反應(yīng)條件：94℃15 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1 min，共45個(gè)循環(huán)；最終72℃3 min。該反應(yīng)在37℃進(jìn)行40 min，然后85℃5 min使酶失活。單堿基延伸反應(yīng)在下列條件下進(jìn)行：94℃30 s；94℃5 s，52℃5 s，80℃5 s 5個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃3 min。使用Mass ARRAY Nanodispenser（Sequenom）將最終的分型產(chǎn)物點(diǎn)樣到一塊384孔的spectro-CHIP（Sequenom）上。并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析，最終結(jié)果由Mass ARRAY RT軟件系統(tǒng)（版本號(hào)3.0.0.4）實(shí)時(shí)讀取，并由Mass ARRAY Typer軟件系統(tǒng)（版本號(hào)3.4）完成基因分型分析。單位點(diǎn)基因型峰圖分辨率誤差設(shè)定為≤0.000 1，總樣本基因型峰圖分辨率誤差設(shè)定為≤0.001，從而使分型的可信度得到保證。分型后的樣本每個(gè)基因型各隨機(jī)抽取30個(gè)樣本（10%）再次進(jìn)行分型，以確保結(jié)果的可靠性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析海洛因依賴組及健康對照組基因型哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg，H-W）檢驗(yàn)采用GENEPOP v4.0，SPSS20軟件計(jì)算病例組和對照組基因型頻率和等位基因頻率，Pearson’s卡方檢驗(yàn)兩組間等位基因頻率和基因型頻率分布差異。非線性logistic回歸分析計(jì)算OR值（odds ratios）以及95%CI（95%confidence intervals）。多重檢驗(yàn)采用Bonferroni法對檢驗(yàn)水準(zhǔn)P值進(jìn)行校正，α值根據(jù)單點(diǎn)總數(shù)及單倍型SNP構(gòu)成數(shù)進(jìn)行設(shè)定。block根據(jù)D′＞0.9以及r2＞0.8進(jìn)行定義。單倍型構(gòu)建采用Haploview 4.0軟件進(jìn)行構(gòu)建。頻率＜5%的單倍型被排除不再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。Pearson’s卡方檢驗(yàn)兩組間單倍型頻率及群體間差異分布。

2 結(jié) 果

BDNF基因7個(gè)SNP位點(diǎn)在海洛因依賴組及健康對照組的基因頻率分布及關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果如下：海洛因依賴組及健康對照組BDNF基因7個(gè)SNP位點(diǎn)的基因頻率分布均符合H-W平衡。1個(gè)block處于強(qiáng)連鎖不平衡（D′＞0.9；r2＞0.8）：rs6265-rs7103873（block 1）。海洛因依賴組及健康對照組BDNF基因7個(gè)位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率及單倍型分別見表1、表2。BDNF基因rs6265與rs13306221位點(diǎn)基因型海洛因攝入劑量比較，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具體結(jié)果見表3。

單位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，在海洛因依賴組及健康對照組中，rs6265基因型頻率分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=15.151，P=0.001）。與健康對照組相比，海洛因依賴組的G等位基因頻率顯著高于健康對照組（χ2=9.864，P=0.002，OR=1.429，95%CI=1.143～1.786）。在海洛因依賴組及健康對照組中，rs13306221基因型頻率分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2= 7.699，P=0.006）。與健康對照組相比，海洛因依賴組G等位基因頻率顯著高于健康對照組（χ2= 7.137，P=0.008，OR=0.539，95%CI=0.340～0.853），但Bonferroni法校正（α=0.007）后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由rs6265、rs7103873位點(diǎn)構(gòu)建的（D′＞0.9；r2＞0.8）單倍型G-G頻率分布在海洛因依賴組及健康對照組中存在差異，健康對照組G-G單倍型頻率顯著高于海洛因依賴組（P=0.033），但Bonferroni法校正（α=0.0167）后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。

表1 BDNF基因型及等位基因頻率在海洛因依賴組及健康對照組中的分布Tab.1 BDNF genotype and allele frequency distribution in heroin dependence group and control group

表2 BDNF基因在block 1中的單倍型頻率及對海洛因依賴的風(fēng)險(xiǎn)Tab.2 BDNF gene in the haploid type in block 1 frequency and risk of heroin dependence

表3 BDNF基因rs6265與rs13306221位點(diǎn)基因型海洛因攝入劑量的比較Tab.3 Comparison of heroin intake dosage between BDNF gene rs6265 and rs13306221 site genotype

圖1 BDNF基因2個(gè)SNP位點(diǎn)（rs6265-rs71038731）連鎖不平衡結(jié)果Fig.1 Linkage disequilibrium results of 2 SNP loci（rs6265-rs71038731）of BDNF gene

3 討 論

BDNF與中樞神經(jīng)元突觸可塑性密切相關(guān)，且與其他神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)基因相互作用。BDNF對幾個(gè)重要的神經(jīng)傳輸系統(tǒng)的生存和傳輸有重要功能，如多巴胺能神經(jīng)元，而這些神經(jīng)傳輸系統(tǒng)可影響物質(zhì)依賴。BDNF在磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3′-kinase，PI3K）、促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，CPLCγ）及核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NFκB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要調(diào)節(jié)作用，從而影響大范圍神經(jīng)元的功能，包括神經(jīng)元的生存、生長、分化、凋亡和結(jié)構(gòu)。這些信號(hào)通路可影響藥物依賴者的腦結(jié)構(gòu)和行為可塑性，表明BDNF在腦的獎(jiǎng)賞系統(tǒng)起著重要作用［12］，從而推測BDNF在藥物依賴的發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用。以上研究表明，BDNF基因是藥物依賴的重要候選基因。

BDNF基因是海洛因等藥物依賴的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。BDNF前體到成熟BDNF的裂解過程是腦內(nèi)BDNF活性的關(guān)鍵程序。rs6265位點(diǎn)Met等位基因是一種特異的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，可以有效地調(diào)節(jié)BDNF分揀和分泌。此等位基因影響海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，導(dǎo)致分揀BDNF前體到分泌這一路徑的缺陷，從而減少總BDNF的分泌。低水平的BDNF有損記憶，增加神經(jīng)精神性疾病的易感性，如抑郁性疾病和帕金森疾?。?3］。相反，一些神經(jīng)元刺激如甲基苯丙胺的使用，使攜帶G等位基因的人分泌較高水平的BDNF［14］。因此，G等位基因的攜帶者因腦內(nèi)BDNF水平和活性的增加，而更易產(chǎn)生海洛因依賴。本研究結(jié)果顯示，在海洛因依賴組中，BDNF基因rs6265位點(diǎn)G等位基因頻率顯著高于正常對照組，與之前報(bào)道結(jié)果一致［15］。如JIA等［16］對中國漢族人群的487例海洛因依賴患者的研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，海洛因依賴組的rs6265位點(diǎn)G等位基因頻率顯著高于正常對照組，這與本研究結(jié)果一致。表明G等位基因攜帶者更易產(chǎn)生海洛因依賴，Val等位基因是藥物依賴的風(fēng)險(xiǎn)因素，且相對A等位基因，G等位基因攜帶者可能有更高濃度的BDNF。與動(dòng)物研究結(jié)果亦一致，在大鼠VTA中注射BDNF可引起長久的可卡因?qū)ひ捫袨椋鳹TA是控制阿片類依賴開關(guān)的解剖區(qū)域，表明高濃度的BDNF易產(chǎn)生藥物依賴，慢性藥物暴露可增加VTA神經(jīng)元的BDNF水平。此外，在VTA神經(jīng)元中注射BDNF，可急劇地增加藥物依賴的幾個(gè)行為效應(yīng)，包括行為敏化和覓藥行為［17］。同樣，在慢性嗎啡暴露的戒斷階段，BDNF的mRNA顯著、快速、持久地升高，此過程涉及戒斷階段的藥物渴求想象［18］。亦有報(bào)道與此結(jié)果相反，如GREENWALD的研究［19］。有趣的是，該位點(diǎn)與酒精依賴無關(guān)。究其原因，海洛因成癮是一個(gè)生理、心理、社會(huì)學(xué)因素綜合作用形成的慢性復(fù)發(fā)性腦病，遺傳因素外其他因素也有一定作用。在關(guān)聯(lián)性研究中，藥物種類、民族、地域、性別以及取樣方法不同亦可造成結(jié)果的差異。本研究的308例海洛因依賴患者均來自中國西安，而GREENWALD等的128例海洛因依賴患者來自美國的底特律市。本研究的研究對象全部為男性，而GREENWALD的研究中男性占70%。此外，研究結(jié)果的差異也可能與形成海洛因依賴的起始年齡有關(guān)，如社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)狀態(tài)、周圍人的使用狀況、藥物的可及性、宗教信仰和父母對藥物使用的態(tài)度均可影響開始使用藥物年齡。無論是合法還是非法藥物，第一次使用的年齡越早，形成藥物成癮的風(fēng)險(xiǎn)越大。因此，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，通過對多個(gè)種群、多個(gè)基因和多個(gè)位點(diǎn)的研究，且控制其他可影響海洛因依賴的因素，從而探索海洛因依賴的遺傳機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，海洛因依賴組rs13306221位點(diǎn)等位基因G頻率顯著高于正常對照組，與之前報(bào)道在海洛因依賴人群中該位點(diǎn)G等位基因頻率增加結(jié)果一致［8，20］。研究表明，位于BDNF基因啟動(dòng)子區(qū)rs13306221多態(tài)性可能改變聚合酶Ⅱ與啟動(dòng)子的親和力，從而影響B(tài)DNF基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)效率。與A等位基因相比，G等位基因的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低［21］。然而，尚需更大樣本量在其他民族與地域中進(jìn)一步研究。

本研究又深入探索了這7個(gè)SNP位點(diǎn)之間的相互關(guān)系。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)由rs6265-rs71038731構(gòu)建的單倍型存在強(qiáng)連鎖不平衡。單倍型分析顯示，與對照組相比，海洛因依賴組G-G單倍型頻率顯著降低。此結(jié)果表明，攜帶BDNF基因的G-G單倍型的患者不易產(chǎn)生海洛因依賴。因此，該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了BDNF多態(tài)性在海洛因依賴中的作用。

總之，本遺傳學(xué)研究有助于更好地理解海洛因依賴的潛在發(fā)病機(jī)制。研究表明了BDNF基因rs6265和rs13306221位點(diǎn)及其相關(guān)的單倍型在海洛因依賴的遺傳易感性中可能發(fā)揮作用。這些SNPs是如何影響B(tài)DNF的功能尚待進(jìn)一步的探討。

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（編輯 卓選鵬）

Association of single nucleotide polymorphisms of brain-derived neurotrophic factor gene with heroin dependence in the Han population of Shaanxi Province

LI Yun-xiao，YIN Fang-yuan，QIAO Xiao-meng，WEI Shu-guang，LAI Jiang-hua
（Department of Forensic Science，Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710061，China）

ObjectiveTo examine the association between the polymorphisms of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）gene with heroin dependence.MethodsGenomic DNA was isolated from the venous blood leukocytes of 308 unrelated patients with heroin dependence and 317 healthy individuals.Seven single nucleotide polymorphisms（SNPs）were genotyped using MassARRAY system.Data were analyzed using Haplo View 4.0 and SPSS 20.0 software.ResultsThere was a significant dif ference in the genotype frequency of rs6265 between heroin dependence group and healthy control group（χ2=15.151，P=0.001）.The rs6265 G allele was significantly higher than in controls（χ2=9.864，P=0.002，OR=1.429，95%CI=1.143-1.786）.Furthermore，there was also a significant difference in the genotype frequency of rs13306221 between heroin dependence group and control group（χ2=7.699，P=0.006）.The rs13306221 G allele was significantly higher than in controls（χ2=7.137，P= 0.008，OR=0.539，95%CI=0.340-0.853）.Strong linkage disequilibrium（LD）was observed in one block（D'＞0.9；r2＞0.8），and significantly less G-G haplotype frequency of block 1（χ2=4.546；P=0.033）was found in heroin dependence group.ConclusionOur findings support the role of BDNF rs6265 and rs13306221 polymorphisms in heroin dependence and may guide future studies to identify other genetic risk factors for heroin dependence.

brain-derived neurotrophic factor（BDNF）；heroin dependence；single nucleotide polymorphism

R89

A

10.7652/jdyxb201506014

2014-11-19

2015-05-07

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.NSFC 81172910）

Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.NSFC 81172910）

賴江華.E-mail：Laijh1011@mail.xjtu.edu.cn

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151014.1742.004.html（2015-10-14）