王笑笑，邢蘭瑛，仲 華，王治榮，樊江波

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004；2.西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004；3.西安未央正泰醫(yī)院，陜西西安 710016；4.西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院，陜西西安 710072）

CD24和OPN在上皮性卵巢腫瘤的表達及其與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系

王笑笑1，2，邢蘭瑛1，仲 華3，王治榮4，樊江波1

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004；2.西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004；3.西安未央正泰醫(yī)院，陜西西安 710016；4.西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院，陜西西安 710072）

目的 探討CD24和OPN在上皮性卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展中的表達，進一步了解卵巢癌的發(fā)病機制及CD24和OPN的高表達對卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)（SP）法，檢測正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤、上皮性卵巢癌中CD24和OPN的表達。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，CD24蛋白的表達水平隨著卵巢正常、良性、交界性和惡性性質(zhì)的變化而逐步上升，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨著臨床分期升高而表達率升高，病理分級升高而表達率降低，表達無組織學(xué)特異性。OPN蛋白的表達水平隨著正常、良性、交界性和惡性性質(zhì)的變化而逐步上升，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；臨床分期升高表達率升高，病理分級升高表達率降低，表達無組織學(xué)特異性。CD24和OPN表達陽性率間呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 CD24、OPN蛋白的高表達在卵巢腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用；CD24和OPN的表達可以預(yù)測卵巢癌的發(fā)展、預(yù)后及復(fù)發(fā)風(fēng)險。

卵巢腫瘤；CD24；OPN；免疫組織化學(xué)；轉(zhuǎn)移

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其中90%左右卵巢惡性腫瘤是卵巢上皮性癌。卵巢癌早期不易診斷，且較易發(fā)生轉(zhuǎn)移和廣泛種植，5年存活率只有25%～30%。目前，認為持續(xù)排卵、內(nèi)分泌因素，遺傳因素及環(huán)境因素可能是卵巢腫瘤發(fā)病的高危因素，卵巢癌的發(fā)病機制仍不明確，可能與多因素引起某些基因表達水平的改變有關(guān)。細胞黏附分子24（cluster of differentiation 24，CD24）是選擇素蛋白家族P選擇素的配體，是一種低分子量高度糖基化的黏蛋白樣的黏附分子，被認為是新的致癌基因和轉(zhuǎn)移促進因子。研究發(fā)現(xiàn)CD24廣泛表達在多種造血系統(tǒng)腫瘤和實體瘤中。并且和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種糖蛋白，具有磷酸和唾液酸酶，被認為是細胞外的一種重要基質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)其對腫瘤生長和瘤體轉(zhuǎn)移有一定的促進作用。CD24和OPN蛋白的陽性率與卵巢上皮性癌發(fā)展的關(guān)連，及CD24和OPN的陽性表達率與卵巢上皮性腫瘤進展有無相關(guān)性，國內(nèi)鮮有報道。本實驗?zāi)康氖抢妹庖呓M織化學(xué)染色法，研究CD24和OPN在卵巢上皮性腫瘤內(nèi)表達及其對侵襲轉(zhuǎn)移的影響，以及CD24和OPN在卵巢上皮性癌表達的相關(guān)性。從而進一步探索卵巢癌的發(fā)病機制，預(yù)測卵巢上皮性癌的發(fā)展及預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 資料來源及標本采集隨機選取西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2009年1月至2012年9月間手術(shù)切除的正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤組織、卵巢交界性上皮性腫瘤、卵巢上皮性癌標本109例。其中正常卵巢組織12例；良性卵巢上皮性腫瘤患者的標本19例，包括卵巢漿液性囊腺瘤，卵巢黏液性囊腺瘤，卵巢子宮內(nèi)膜樣腫瘤；卵巢交界性上皮性腫瘤標本有18例，包括交界性漿液性囊腺癌和交界性黏液性囊腺癌；卵巢惡性上皮性腫瘤60例，其中有漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌和子宮內(nèi)膜樣癌。109例卵巢組織的蠟塊標本均是手術(shù)后2 h內(nèi)的新鮮標本，并于4℃下使用100 m L/L甲醛（p H值7.2～7.4）固定6～12 h，且固定后經(jīng)充分水洗并石蠟封存。

病例納入與排除標準：①研究對象為首發(fā)病例，術(shù)前三個月內(nèi)均未接受任何放化療治療；②無合并其他任何系統(tǒng)的惡性腫瘤；③所用組織標本都經(jīng)病理科專家盲法閱片診斷；④所用標本組織均取自相應(yīng)患者；⑤相應(yīng)患者病歷資料完整。

患者的年齡：良性卵巢上皮性腫瘤組的年齡為19～71歲，交界性卵巢上皮性腫瘤患者的年齡為27～74歲，上皮性卵巢惡性腫瘤患者組的年齡為23～72歲。臨床分期采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2000年制定的標準（EIGO 2000年）進行分期。60例卵巢癌EIGO分期為：Ⅰ期11例、Ⅱ期14例、Ⅲ期20例、Ⅳ期15例。依據(jù)WHO標準行組織學(xué)的分型，包括：19例漿液性囊腺癌，23例黏液性囊腺癌，18例子宮內(nèi)膜樣癌。病理組織學(xué)分級，包括：高分化（G1）組16例，中分化（G2）組14例，低分化（G3）組30例。術(shù)中發(fā)現(xiàn)有腹水者39例，無腹水者21例；術(shù)后病理結(jié)果證實的有18例發(fā)生淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，42例未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。

1.2 主要試劑鼠抗人CD24單克隆抗體（克隆號：MAB847），R&D Systems，濃縮型，稀釋濃度為1∶75，鼠抗人OPN單克隆抗體（克隆號：28h6），R&D Systems，濃縮型，稀釋濃度為1∶75。即用型二抗檢測試劑盒［A試劑增強劑、B試劑酶標羊抗鼠/（兔）聚合物］。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法將石蠟切片進行脫蠟、水化及抗原修復(fù)，每張切片加入30 m L/L H2O2液，目的是除掉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次后，甩去PBS液，每張切片滴加1滴相應(yīng)的第一抗體（CD24抗體或OPN抗體），4℃冰箱過夜。PBS沖洗3次，甩去PBS液，每張切片滴加1滴聚合物增強劑（試劑A），室溫放置15 min。PBS沖洗3次，甩去PBS液，每張切片滴加1滴二抗酶標抗鼠/（兔）聚合物（試劑B），室溫放置15 min，PBS沖洗3次，進行DAB顯色2～5 min，流水洗至顯色停止，蘇木素復(fù)染脫水透明和中性樹膠封片，而后鏡下觀察。選取肺癌組織CD24/OPN陽性表達作為陽性組的對照。陰性組的對照采用PBS代替CD24/OPN，實驗標本嚴格按照實驗要求進行染色，而且染色是在每批中隨機抽取進行的。

1.4 結(jié)果判斷由資深的病理科醫(yī)生在顯微鏡下進行雙盲閱片。判定標準：每例標本隨機選10個高倍鏡視野，每視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)選取視野細胞著色強度、陽性細胞百分率結(jié)果分析。CD24免疫組化染色陽性信號定位于胞膜和（或）胞質(zhì)，OPN陽性信號定位于胞核，均呈黃色顆粒，顯色強時為棕黃色。按照陽性細胞比例計分，不表達為（-），＜10%計（+），10%～50%計（++），＞50%計（+++）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。CD24、OPN在組織中的表達水平用百分率表示，進行χ2檢驗、Eisher's確切概率法檢驗。CD24和OPN在卵巢腫瘤組織中表達的相關(guān)性研究采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD24在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達CD24蛋白的表達率水平隨著正常、良性、交界性和惡性的變化而逐步上升，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1、圖1）。

2.2 CD24蛋白的表達與上皮性卵巢癌臨床病理之間的關(guān)系CD24蛋白的表達隨著卵巢上皮性癌臨床分期升高、病理分級降低其陽性表達率逐漸上升。陽性表達率與上皮性卵巢癌的組織學(xué)分型無關(guān)（表2）。

表1 CD24在不同卵巢組織中的表達Tab.1 The expression of CD24 in different ovary tissues

圖1 CD24和OPN在不同卵巢組織中的表達Eig.1 The expression of CD24 and OPN in different ovary tissues

表2 CD24的表達與卵巢癌臨床病理之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression level of CD24 in ovarian cancer and clinicopathological parameters

2.3 OPN在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達OPN蛋白的表達率隨著正常、良性、交界性和惡性的變化而逐步上升，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表3、圖1）。

2.4 OPN蛋白的表達與上皮性卵巢癌臨床病理之間的關(guān)系隨著卵巢上皮性癌的臨床分期升高和病理分級降低，OPN的陽性表達率逐漸升高；陽性表達率與上皮性卵巢癌的組織學(xué)分型無關(guān)（表4）。

2.5 相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)法進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果提示CD24和OPN在卵巢上皮性癌組織中表達具有相關(guān)性（表5）（rs=0.808，P＜0.001）。

3 討 論

近年發(fā)現(xiàn)在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中CD24作為黏附分子發(fā)揮著重要的作用。它參與腫瘤細胞的增殖分化和凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。CD24被認為是新的致癌基因和轉(zhuǎn)移促進因子，在多種系統(tǒng)的腫瘤中表達。CD24是高度糖基化的黏蛋白，具有27個氨基酸小片段，經(jīng)由甘油磷脂酰肌醇與細胞表面連接［1］。研究證實糖基化的CD24是高度變異具有細胞類型依賴性的。CD24有使細胞和細胞間、細胞和基質(zhì)間粘附的作用，其糖基化作用是作為細胞連接點上分子間相互傳遞信號的媒體。研究發(fā)現(xiàn)CD24廣泛表達在多種造血系統(tǒng)腫瘤和實體瘤中［2-5］，并且和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)。OPN是一種磷酸化蛋白，具有多種生理病理功能［6］，最早是由SENGER在1979年將其作為一種與惡性腫瘤相關(guān)的蛋白提出來的［7］。人OPN結(jié)構(gòu)中有大量絲氨酸與天冬氨酸殘基，包含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Glu-Asp，RGD）結(jié)構(gòu)域，這使它與受體的結(jié)合增強，進而增強細胞的粘附，在細胞的移行過程中起重要作用。RGD結(jié)構(gòu)還能使OPN對基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）激活，從而增強腫瘤細胞的侵襲和瘤體的轉(zhuǎn)移［8-10］。OPN可以促進腫瘤細胞的生長和增殖，誘導(dǎo)新生血管的形成，促進腫瘤細胞的黏附和轉(zhuǎn)移以及通過多種途徑參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。

表3 OPN在不同卵巢組織中的表達Tab.3 The expression of OPN in different ovary tissues

表4 OPN的表達與卵巢癌的臨床病理之間的關(guān)系Tab.4 Relationship between the expression level of OPN in ovarian cancer and clinicopathological parameters

表5 CD24與OPN表達的相關(guān)性Tab.5 The correlation of the expression levels of CD24 and OPN in ovarian cancer

本實驗結(jié)果顯示，CD24在正常卵巢組織不表達，在良性、交界性、惡性上皮性卵巢組織中的表達逐漸上升；OPN在正常、良性、交界性、惡性上皮性卵巢組織的陽性表達率逐漸上升，且二者在上皮性卵巢癌的陽性表達率明顯高于良性及交界性上皮性卵巢腫瘤組織的陽性表達率。隨著上皮性卵巢癌的臨床分期升高，CD24、OPN蛋白的陽性表達率升高，提示CD24、OPN的高表達與卵巢癌臨床分期有關(guān)。上皮性卵巢癌病理分級升高，CD24、OPN的陽性表達率降低，提示CD24、OPN的高表達與上皮性卵巢癌的病理分級有關(guān)。CD24、OPN表達率與上皮性卵巢癌的組織學(xué)分型無關(guān)。采用Spearman等級相關(guān)法進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果提示CD24和OPN在卵巢上皮性癌組織中表達具有相關(guān)性（rs=0.808，P＜0.001）。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CD24在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌［11-15］等上皮來源的腫瘤組織中呈高表達。相關(guān)研究證實侵襲癌患者CD24高表達者生存期明顯呈下降。對CD24的表達抑制能夠明顯降低瘤體細胞的增殖轉(zhuǎn)移與浸潤能力。YANG等發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性肝細胞癌組織和肝細胞癌復(fù)發(fā)的組織中CD24表達明顯較高，術(shù)后經(jīng)介入栓塞動脈血管能夠使CD24陽性表達的肝細胞癌患者的復(fù)發(fā)率降低。CD24與Wnt/β-catenin通路的活化有關(guān)聯(lián)。進而說明細胞中CD24的過表達和腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切有關(guān)。實驗還提示CD24高表達是肝細胞癌術(shù)后不良預(yù)后的一個指標。

ROSEN等［16］研究發(fā)現(xiàn)OPN與卵巢腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系，在正常的卵巢細胞中表達陰性，在卵巢良性囊腺瘤、交界性卵巢腫瘤與漿液性惡性卵巢腫瘤表達逐漸上升。本研究結(jié)果進一步說明OPN可能和卵巢惡性腫瘤發(fā)展相關(guān)。通過對OPN蛋白在卵巢良、惡性腫瘤中的表達情況和臨床各參數(shù)之間的關(guān)系進行分析研究，提示OPN在卵巢癌的發(fā)生進展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮著重要的作用。OPN蛋白對于促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用與腫瘤的組織來源關(guān)系不大，這也與我們近年來的研究相一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CD24和OPN在上皮性卵巢癌的惡性生物學(xué)行為中起重要作用，其高表達者，卵巢上皮性癌的惡性程度較高，臨床預(yù)后差，易于發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，其可作為判斷卵巢癌轉(zhuǎn)移和惡性程度的一種生物學(xué)指標。根據(jù)CD24和OPN在上皮性卵巢癌中的表達規(guī)律，及其表達率與卵巢上皮性癌侵襲、轉(zhuǎn)移行為間的關(guān)系，可為卵巢癌的診斷治療和預(yù)后評估開辟一條新的途徑。二者共同表達可能有協(xié)同作用。共同增強細胞黏附，增強瘤體的侵襲和轉(zhuǎn)移。對二者的檢測可能更好的預(yù)測卵巢上皮性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后。兩者高表達可能預(yù)測著術(shù)后復(fù)發(fā)的危險，但二者是否相互協(xié)同促進表達，其具體機制仍需進一步研究，探索二者在卵巢上皮性腫瘤的表達及相互關(guān)系為監(jiān)測卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和預(yù)后提供了更廣闊的空間和思路。

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（編輯 韓維棟）

Expression of CD24 and OPN in ovarian epithelial tumor and their relationship with invasion metastasis

WANG Xiao-xiao1，2，XING Lan-ying1，ZHONG Hua3，WANG Zhi-rong4，EAN Jiang-bo1
（1.Department of Gynecology and Obstetrics，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710004；2.Department of Gynecology and Obstetrics，Xi'an No.4 Hospital，Xi'an 710004；3.Xi'an Weiyang Zhengtai Hospital，Xi'an 710016；4.Northwestern Polytechnical University Hospital，Xi'an 710072，China）

Objective To investigate the expression of cluster of differentiation 24（CD24）and osteopontin（OPN）in ovarian epithelial tumor so as to further explore the pathogenesis of ovarian cancer and the effects of high expression of CD24 and OPN on invasion and metastasis in ovarian cancer.Methods Immunohistochemistry was employed to determine the expression of CD24 and OPN in the normal，benign，borderline and ovarian cancer tissues.Results The immunohistochemical results showed the positive expression of CD24 gradually increased with the changes of normal，benign，border and malignant nature in ovarian epithelial tumor.There were significant differences between all the groups（P＜0.05）.The advanced the clinical stage，the higher the expression rate.The higher the pathological classification，the lower the expression rate.CD24 protein expression did not have histological specificity.The positive expression of OPN gradually increased with the changes of normal，benign，border and malignant nature in ovarian epithelial tumor.All the groups differed significantly（P＜0.05）.The more advanced the clinical stage，the higher the expression rate.The higher the pathological classification，the lower the expression rate.OPN protein expression had no histological specificity.The positive rate of CD24 and OPN expression was positively correlated in ovarian epithelial tumor（P＜0.05）.Conclusion The high expression of CD24 and OPN protein plays an important role in the occurrence，development，invasion and metastasis of ovarian tumor.The expression of CD24 and OPN can predict the progression，prognosis and recurrence risk of ovarian cancer.

ovarian tumor；cluster of differentiation 24（CD24）；osteopontin（OPN）；immunocytochemistry；metastasis

R711.75

A

10.7652/jdyxb201505019

2014-07-08

2014-11-28

陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目（No.2015SE117）Supported by the Social Pevelopment Research Project of Shaanxi Province（No.2015SE117）

邢蘭瑛.E-mail：Eang990@people.com.cn

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150515.0950.005.html（2015-05-15）