李維宏，牟曉玲

·論著·

黃體酮保胎治療對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血輔助性T淋巴細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞免疫失衡的影響研究

李維宏，牟曉玲

目的評價(jià)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)患者黃體酮保胎治療前后外周血輔助性T淋巴細(xì)胞17 (Th17)/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)變化及其與妊娠結(jié)局的關(guān)系。方法選取2013年1月—2014年1月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科門診診治的URSA患者30例為URSA組，給予黃體酮20 mg/d肌肉注射治療，孕56 d行B超檢查確定有無胎心，根據(jù)妊娠結(jié)局分為保胎成功組22例和保胎失敗組8例。同時(shí)選擇同時(shí)期本院婦產(chǎn)科門診手術(shù)室收治的妊娠12周以內(nèi)要求人工流產(chǎn)的正常早孕婦女15例作為對照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Th17和Treg數(shù)量;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測外周血清中白介素(IL)－4、IL－10、IL－17水平;采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)法檢測PBMC中Th17、Treg轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(RORγt)、叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(FoxP3)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果治療前，保胎成功組、保胎失敗組患者PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞及Th17/Treg高于對照組，Treg/CD4+細(xì)胞低于對照組(P＜0．05);治療后，保胎失敗組患者PBMC中Th17/CD4

+細(xì)胞及Th17/Treg高于保胎成功組，Treg/CD4+細(xì)胞低于保胎成功組(P＜0．05)。治療前，保胎成功組、保胎失敗組患者外周血清中IL－4、IL－10水平低于對照組，IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10高于對照組(P＜0．05);治療后，保胎失敗組患者外周血清中IL－4、IL－10水平低于保胎成功組，IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10高于保胎成功組(P＜0．05)。治療前，保胎成功組、保胎失敗組患者PBMC中RORγtmRNA表達(dá)水平高于對照組，F(xiàn)oxP3 mRNA表達(dá)水平低于對照組(P＜0．05);治療后，保胎失敗組患者PBMC中RORγtmRNA表達(dá)水平高于保胎成功組，F(xiàn)oxP3 mRNA表達(dá)水平低于保胎成功組(P＜0．05)。結(jié)論URSA與Th17/Treg免疫平衡異常密切相關(guān)，黃體酮保胎治療可通過下調(diào)Th17/Treg及相應(yīng)細(xì)胞因子水平，改善URSA患者的Th17/Treg免疫失衡而改善妊娠結(jié)局。

流產(chǎn)，習(xí)慣性;孕酮;T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性;T淋巴細(xì)胞，輔助誘導(dǎo)

李維宏，牟曉玲．黃體酮保胎治療對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血輔助性T淋巴細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞免疫失衡的影響研究［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(36):4444－4449．［www．chinagp．net］

LiWH，Mou XL．Effectof progesterone treatmenton Th17/Treg imbalance of peripheral blood in patientswith unexplained recurrent spontaneous abortion［J］．Chinese General Practice，2015，18(36)4444－4449．

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)是一類常見的妊娠疾病，發(fā)病率高，與患者體內(nèi)母胎免疫耐受異常密切相關(guān)。孕激素是維持妊娠最基本的激素，在妊娠的建立和維持中發(fā)揮重要的作用［1］。黃體酮是一類天然的孕激素，可以補(bǔ)充黃體功能，減少妊娠子宮的興奮性，調(diào)節(jié)母胎免疫環(huán)境［2］，是臨床保胎治療的主要手段。但臨床上URSA采用黃體酮保胎治療仍有部分保胎治療失敗，且原因不明［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)在妊娠中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，與妊娠結(jié)局密切相關(guān)［5］。但Th17/Treg改變與保胎治療后妊娠結(jié)局的關(guān)系如何，其能否成為預(yù)測妊娠結(jié)局成功與否的標(biāo)志物，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究旨在評價(jià)URSA患者黃體酮保胎治療前后及不同妊娠結(jié)局時(shí)外周血Th17/Treg的差異，評估Th17/Treg改變對預(yù)測臨床保胎治療妊娠結(jié)局的價(jià)值，為URSA的治療和預(yù)后評價(jià)提供新的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1資料與方法

1．1臨床資料選取2013年1月—2014年1月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科門診診治的URSA患者30例為URSA組，年齡25～35歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)連續(xù)發(fā)生2次或2次以上早期自然流產(chǎn)，末次流產(chǎn)發(fā)生于1年以內(nèi);(2)夫婦雙方染色體檢查正常;(3)女方生殖道無畸形;(4)陰道、宮頸分泌物檢查排除生殖道感染;(5)Torch檢查陰性;(6)生殖內(nèi)分泌激素測定正常;(7)抗磷脂抗體等自身免疫抗體陰性;(8)男方精液常規(guī)檢查正常;(9)未行免疫治療;(10)近3個(gè)月未使用激素類藥物。同時(shí)選擇同時(shí)期本院婦產(chǎn)科門診手術(shù)室收治的妊娠12周以內(nèi)要求人工流產(chǎn)的正常早孕婦女15例作為對照組?；颊呔橥狻?/p>

1．2主要儀器和試劑黃體酮注射液購自天津金耀氨基酸有限公司(規(guī)格20 mg/ml，批號:120304);小鼠抗人PE－Cy7－CD4、異硫氰酸熒光素(FITC)－IL－17A、FITC－CD25、PE－叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3 (FoxP3)+單克隆抗體及相應(yīng)的熒光標(biāo)記同型對照抗體，流式固定液和破膜劑均購自eBioscience公司;淋巴細(xì)胞分離液購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;人白介素(IL)－4、IL－10、IL－17酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自R＆D公司;佛波酯、伊諾霉素和布雷菲德菌素A購自Sigma公司;TRNzol總RNA抽提試劑購自天根

本研究創(chuàng)新點(diǎn):

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)是一類常見的妊娠病理狀態(tài)，嚴(yán)重影響患者的身心健康和家庭幸福。確定發(fā)病機(jī)制、找到治療的具體靶點(diǎn)是URSA的研究方向。黃體酮是傳統(tǒng)的保胎用藥，具有補(bǔ)充黃體功能、放松子宮、保護(hù)妊娠的作用，但并不是所有患者黃體酮治療有效。研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)是一對重要的免疫細(xì)胞，在母胎免疫耐受中發(fā)揮重要的作用，Th17對妊娠不利，Treg可以保護(hù)妊娠，但Th17/Treg與妊娠結(jié)局有無相關(guān)性，黃體酮治療對Th17/Treg是否有影響，Th17/Treg是否可以預(yù)測保胎治療妊娠結(jié)局尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究評價(jià)URSA患者黃體酮保胎治療前后及不同妊娠結(jié)局時(shí)外周血Th17/Treg的差異，發(fā)現(xiàn)Th17/Treg改變對臨床保胎治療妊娠結(jié)局的預(yù)測有重要價(jià)值，為進(jìn)一步明確URSA的發(fā)病機(jī)制、URSA保胎治療的預(yù)后評價(jià)提供了新的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。生化科技(北京)有限公司;PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司;引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;酶標(biāo)儀購自BIO－RAD公司(550型)，流式細(xì)胞儀購自Beckman公司(FACS Calibur and Cell Quest Pro型)。

1．3保胎治療及分組URSA患者發(fā)現(xiàn)停經(jīng)32 d，尿人絨毛膜促性腺激素(HCG)(+)之日起，給予黃體酮20 mg/d肌肉注射治療，至孕56 d行B超檢查確定有無胎心。根據(jù)妊娠結(jié)局分為保胎成功組(B超檢查確定宮內(nèi)活胎)和保胎失敗組(B超檢查發(fā)現(xiàn)無胎心)。記錄URSA患者基本情況及黃體酮保胎治療妊娠結(jié)局。

1．4標(biāo)本收集URSA患者黃體酮保胎治療前后無菌采集肘靜脈血11 ml。1管8 m l，肝素抗凝，采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整細(xì)胞濃度后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。對照組患者不給藥，僅抽取術(shù)前的血液標(biāo)本行相同處理后待測;另1管3 m l，全血不抗凝，6 000 r/min離心10 min(離心半徑為6 cm)，收集血清，－20℃保存待測血清細(xì)胞因子水平。

1．5流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC中Th17和Treg數(shù)量調(diào)整PBMC懸液濃度至1×107/m l，200μl/管。檢測Th17時(shí)需先加入終濃度為0．05 ng/L的佛波酯、1μmol/L的伊諾霉素和10 ng/L的布雷菲德菌素A，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。PBS洗滌后加入PE－Cy7－CD4單克隆抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌、固定和破膜后再加入FITC－IL－17A單克隆抗體，4℃避光孵育20 min。檢測Treg時(shí)需先加入PE－Cy7－CD4、FITC－CD25單克隆抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌、固定并破膜后加入PE－FoxP3+單克隆抗體，4℃避光孵育20 min。采用相應(yīng)熒光標(biāo)記的同型對照IgG1染色細(xì)胞作為陰性對照，以上處理好的細(xì)胞均用PBS反復(fù)洗滌3次后重懸為500 μl/管，樣品置流式細(xì)胞儀檢測CD4+IL－17A+細(xì)胞和CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例。

1．6 ELISA法檢測血清IL－4、IL－10、IL－17水平參照ELISA試劑盒說明書，采用人IL－4、IL－10、IL－17 ELISA試劑盒檢測各組血清中IL－4、IL－10、IL－17水平，所有樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1．7反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)檢測Th17、Treg轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(RORγt)、FoxP3 mRNA表達(dá)水平取各組PBMC懸液5×106/管，1 500 r/min離心5 min(離心半徑為6 cm)，棄上清液后加入1 m l TRNzol總RNA抽提試劑，參照TRNzol試劑說明書，提取PBMC中總RNA;瓊脂糖凝膠電泳及檢測RNA完整性及純度;按PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。引物序列如下: RORγt上游引物:5'－GGC TCC CTG GAT GAA TAG AAT G－3'，下游引物:5'－AGG CAG AGG CAG AAA ATG TAA AG－3'，產(chǎn)物大小190 bp;FoxP3上游引物: 5'－ATG CGA CCC CCT TTC ACC TAC－3'，下游引物: 5'－TGG CGG ATG GCG TTC TTC－3'，產(chǎn)物大小155 bp;β－actin上游引物:5'－CCC TGT ATG CCT CTG GTC－3'，下游引物:5'－GTC TTT ACG GAT GTC AAC G－3'，產(chǎn)物大小540 bp。PCR產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳，Quantity One圖像采集系統(tǒng)及分析軟件對電泳條帶進(jìn)行分析處理，RORγt、FoxP3 mRNA相對表達(dá)水平用其條帶校正灰度值與β－actin校正灰度值之比表示。

1．8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1兩組一般資料比較及URSA患者黃體酮保胎治療妊娠結(jié)局URSA組與對照組患者年齡、體質(zhì)指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見表1)。URSA患者既往平均流產(chǎn)數(shù)為(3．7±1．2)次，經(jīng)黃體酮保胎治療后，22例孕56 d時(shí)B超檢查發(fā)現(xiàn)有胎心，納入保胎成功組;8例B超檢查未發(fā)現(xiàn)胎心，納入保胎失敗組。

表1對照組與URSA組患者年齡、體質(zhì)指數(shù)比較(x±s)Table 1 Comparison of age and bodymass index between control group and URSA group

2．2對照組與不同妊娠結(jié)局URSA組患者PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞、Treg/CD4+細(xì)胞及Th17/Treg比較治療前，對照組、保胎成功組、保胎失敗組患者PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞、Treg/CD4+細(xì)胞及Th17/Treg比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);其中，保胎成功組、保胎失敗組患者PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞及Th17/Treg高于對照組，Treg/CD4+細(xì)胞低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。治療后，保胎失敗組患者PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞及Th17/Treg高于保胎成功組，Treg /CD4+細(xì)胞低于保胎成功組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。保胎成功組患者治療后PBMC中Th17/CD+4細(xì)胞及Th17/Treg低于治療前，Treg/CD4+細(xì)胞高于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);保胎失敗組患者治療后PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞、Treg/CD4+細(xì)胞、Th17/Treg與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見表2)。

2．3對照組與不同妊娠結(jié)局URSA組患者外周血清中IL－4、IL－10、IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17 /IL－10比較治療前，對照組、保胎成功組、保胎失敗組患者外周血清中IL－4、IL－10、IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);其中，保胎成功組、保胎失敗組患者外周血清中IL－4、IL－10水平低于對照組，IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。治療后，保胎失敗組患者外周血清中IL－4、IL－10水平低于保胎成功組，IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10高于保胎成功組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。保胎成功組患者治療后外周血清中IL－4、IL－10水平高于治療前，IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);保胎失敗組患者治療后外周血清中IL－4、IL－10、IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見表3)。

2．4對照組與不同妊娠結(jié)局URSA組患者PBMC中Th17/Treg轉(zhuǎn)錄因子RORγt、FoxP3 mRNA表達(dá)水平比較治療前，對照組、保胎成功組、保胎失敗組患者PBMC中Th17/Treg轉(zhuǎn)錄因子RORγt、FoxP3 mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);其中，保胎成功組、保胎失敗組患者PBMC中Th17/Treg轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA表達(dá)水平高于對照組，F(xiàn)oxP3 mRNA表達(dá)水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。治療后，保胎失敗組患者PBMC中Th17/Treg轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA表達(dá)水平高于保胎成功組，F(xiàn)oxP3 mRNA表達(dá)水平低于保胎成功組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。保胎成功組患者治療后PBMC中Th17/Treg轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)水平低于治療前，F(xiàn)oxP3 mRNA表達(dá)水平高于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);保胎失敗組患者治療后PBMC中Th17/Treg轉(zhuǎn)錄因子RORγt、FoxP3 mRNA表達(dá)水平與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見表4、圖1)。

表2對照組與不同妊娠結(jié)局URSA組患者PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞、Treg/CD4+細(xì)胞及Th17/Treg比較(x±s)Table2 Comparison of Th17/CD4+cells，Treg/CD4+cells and Th17/Treg in PBMC between control group and URSA groups with different pregnancy outcomes

表3對照組與不同妊娠結(jié)局URSA組患者外周血清中IL－4、IL－10、IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10比較(x±s)Table 3 Comparison of IL－4，IL－10，IL－17 levels and IL－17/IL－4，IL－17/IL－10 in the serum between control group and URSA groups with different pregnancy outcomes

表4對照組與不同妊娠結(jié)局URSA組患者PBMC中Th17、Treg轉(zhuǎn)錄因子RORγt、FoxP3 mRNA表達(dá)水平比較(x±s)Table 4 Comparison of expression of Th17 and Treg transcription factor RORγt and FoxP3 mRNA in PBMC between control group and URSA groups with different pregnancy outcomes

圖1 RT－PCR法檢測Th17、Treg轉(zhuǎn)錄因子RORγt、FoxP3 mRNA表達(dá)水平Figure 1 Expression of Th17 and Treg transcripation factor RORγt and FoxP3 mRNA by RT－PCR

3討論

正常生理妊娠類似于同種半異體移植，作為同種半異體移植物的胚胎能在母體內(nèi)存活并發(fā)育，胎兒所攜帶的父系抗原刺激母體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，如果母體對胚胎的免疫耐受出現(xiàn)異常，則誘發(fā)母體對胚胎的排斥反應(yīng)，如果這種排斥反應(yīng)持續(xù)存在，就會發(fā)生URSA。

Treg是一類特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3，具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能的CD4+細(xì)胞，可通過細(xì)胞間接觸抑制及分泌抑制性細(xì)胞因子等途徑發(fā)揮抗炎和維持自身免疫耐受的作用［6］。Treg所介導(dǎo)的免疫抑制在母體免疫耐受中起關(guān)鍵作用，Treg在數(shù)量和功能上的缺陷有可能導(dǎo)致URSA，對母體免疫耐受的維持有重要意義［7］。Th17是一種具有IL－23依賴性分泌IL－17的Th細(xì)胞亞群，具有很強(qiáng)的促炎作用，其被認(rèn)為與免疫性疾病密切相關(guān)［8－9］，與Treg存在復(fù)雜的相互關(guān)系［10］。RORγt是IL－17細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄所必需的，是Th17分化必不可少的轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子RORγt和FoxP3決定了Th17和 Treg分化方向。研究發(fā)現(xiàn)，URSA的發(fā)生與患者Th17/Treg免疫失衡密切相關(guān)，URSA患者外周血和子宮蛻膜組織的Th17水平明顯升高而Treg水平明顯降低［11］，提示Th17/Treg免疫平衡在妊娠中發(fā)揮重要的作用，是誘導(dǎo)母體免疫耐受、保護(hù)妊娠的重要環(huán)節(jié)［10］。

黃體酮是一類天然的孕激素，具有保胎作用，在臨床廣泛應(yīng)用［12－13］。Maeda等［14］報(bào)道，黃體酮可以使URSA患者外周血PBMC中Th1型細(xì)胞因子分泌降低，Th2型細(xì)胞因子分泌增加，發(fā)揮妊娠保護(hù)作用，但黃體酮保胎治療是否會引起Th17/Treg的改變和Th17/Treg改變是否與黃體酮保胎治療妊娠結(jié)局密切相關(guān)目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，治療前，保胎成功組、保胎失敗組患者PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞、Th17/Treg、外周血清中IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10高于對照組，PBMC中Treg/CD4+細(xì)胞、外周血清中IL－4、IL－10水平低于對照組;治療后，保胎失敗組患者PBMC中Th17/CD4+細(xì)胞及Th17/Treg、外周血清中IL－17水平及IL－17/IL－4、IL－17/IL－10高于保胎成功組，PBMC中Treg/CD4+細(xì)胞、外周血清中IL－4、IL－10水平低于保胎成功組。URSA患者Th17及相關(guān)細(xì)胞因子較對照組患者明顯增加，Treg及相關(guān)細(xì)胞因子水平較對照組患者明顯降低，黃體酮保胎治療后URSA患者外周血清中Th17/Treg改變與妊娠結(jié)局密切相關(guān)。上述結(jié)果與Singh等［11］和La Rocca等［15］的文獻(xiàn)報(bào)道相符，提示URSA患者外周血清中存在Th17/Treg免疫失衡，主要表現(xiàn)在Th17水平升高，Treg水平降低，Th17/Treg上調(diào)。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，黃體酮保胎成功組患者Th17及IL－17水平較治療前明顯下降，Treg及IL－4、IL－10水平較治療前明顯升高，Th17/Treg明顯下調(diào)，并伴隨FoxP3 mRNA表達(dá)水平的增加和RORγtmRNA水平的降低;另一方面，黃體酮保胎失敗組患者Th17/Treg及相應(yīng)細(xì)胞因子與治療前無差異，Treg轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 mRNA表達(dá)水平和Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA表達(dá)水平也顯示與治療前無差異。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證實(shí)了Th17、Treg參與了URSA的發(fā)生，同時(shí)進(jìn)一步表明，黃體酮保胎治療可以引起URSA患者Th17/Treg的改變，主要表現(xiàn)為降低Th17水平和相應(yīng)的細(xì)胞因子IL－17水平，并升高Treg水平和相關(guān)細(xì)胞因子IL－4、IL－10水平，從而降低Th17/Treg，恢復(fù)URSA患者的Th17/Treg免疫平衡。

本研究同時(shí)提示，治療后，保胎失敗組患者Th17 /Treg、IL－17/IL－4、IL－17 3種指標(biāo)高于保胎成功組，且治療后與治療前比較無差異，提示保胎治療后URSA患者的Th17/Treg免疫平衡與保胎治療妊娠結(jié)局密切相關(guān)，只有明顯降低Th17水平，升高Treg水平，恢復(fù)URSA患者外周血中異常升高的Th17/Treg，才能有效降低患者的流產(chǎn)率，改善妊娠結(jié)局。降低Th17/Treg可能是未來保胎治療的方向，其內(nèi)在機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，外周血清Treg水平降低，會使母體對胚胎的免疫耐受降低，同時(shí)Th17水平增加，使母體對胚胎的免疫排斥增強(qiáng)導(dǎo)致妊娠失敗。黃體酮可以通過下調(diào)Th17/Treg，使具有流產(chǎn)傾向妊娠婦女體內(nèi)母胎免疫耐受增強(qiáng)，降低流產(chǎn)率。Th17/Treg對妊娠結(jié)局具有一定的預(yù)測價(jià)值，但黃體酮是如何參與Th17/Treg的調(diào)控在本研究未展開探討，一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯:陳素芳)

·世界全科醫(yī)學(xué)工作瞭望·

標(biāo)準(zhǔn)·方案·指南——美國心臟病學(xué)會(AHA)川崎病診斷指南

主要臨床表現(xiàn)

發(fā)熱持續(xù)5 d以上并伴有下列5項(xiàng)主要特點(diǎn)中的至少4項(xiàng)者:(1)四肢的變化:在急性期，手足的紅斑和水腫，在康復(fù)期，指尖的膜狀脫屑; (2)多形性皮疹;(3)不伴有滲出液的雙側(cè)無痛性球結(jié)膜充血;(4)口唇和口腔的變化:口唇潮紅和皸裂，草莓舌，口腔和咽部黏膜彌漫性發(fā)紅;(5)頸部淋巴結(jié)腫脹(直徑≥1．5 cm)，通常為單側(cè)。

注:發(fā)熱伴上述主要臨床表現(xiàn)不足4項(xiàng)者，若二維超聲心動圖或冠狀動脈造影發(fā)現(xiàn)冠狀動脈疾病，可診斷為川崎病。應(yīng)當(dāng)排除其他疾病，需注意，某些患兒雖然未滿足上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，也可發(fā)展為冠狀動脈瘤。許多專家認(rèn)為，在臨床表現(xiàn)典型的情況下，有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生能在發(fā)熱到5 d之前，即做出川崎病的診斷。

(摘自《嶺南心血管病雜志》)

Effect of Progesterone Treatment on Th17/Treg Imbalance of Peripheral Blood in PatientsW ith Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion

LIWei－h(huán)ong，MOU Xiao－ling．Department of Gynaecology and Obstetrics，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

ObjectiveTo evaluate the changes of Th17/Treg in peripheral blood of unexplained recurrent spontaneous abortion(URSA)patients treated by progesterone and its relationship with pregnancy outcomes．Methods At total of 30 URSA patientswho

treatment in Obstetrics and Ggynecology Outpatient Clinic of the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from January 2013 to January 2014 and 15 normal early pregnancy patients who accepted induced abortion at the same period as controlgroup were included in the study．On URSA patients，progesterone of20mg/d was administrated and B－ultrasound was taken to determine the fetal heart at56 day of pregnancy，According the pregnancy outcomes，URSA patients were classified into successful treatmentgroup(n=22)and failure treatmentgroup(n=8)．The numbersof Th17 and Treg cells inmononuclear cells in peripheral blood(PBMC)were detected by flow cytometry;the levels of serum IL－4，IL－10，IL－17levelwere observed by ELISA;the expressions of transcription factor RORγt and FoxP3 mRNA were detected by RT－PCR．Results The ratios of Th17/CD4+cells and Th17/Treg in URSA patients before progesterone treatmentwere significantly higher and the ratio of Treg/CD4+cellswas significantly lower than the control group(P＜0．05)．The ratios of Th17/CD4+cells and Th17/Treg in failure treatment group after treatmentwere significantly higher than successful treatment group，while Treg/CD+4cells was significantly lower than the successful treatment group(P＜0．05)．Serum IL－4 and IL－10 levels were obviously lower and IL－17 level，the ratios of IL－17/IL－4 and IL－17/IL－10 were significantly higher in URSA patients before progesterone treatment than the control group．After treatment，the levels of IL－4 and IL－10 in failure treatment group were significantly lower than the successful treatment group(P＜0．05)and IL－17 level，the ratios of IL－17/IL－4 and IL－17 /IL－10 were significantly higher than the successful treatment group(P＜0．05)．In URSA patients，expression of RORγt mRNA was significantly higher and FoxP3mRNA level expression was significantly lower than the control group before treatment，while after treatment，expression of RORγtmRNA was higher and FoxP3 mRNA level expression was lower in failure group than in successful group(P＜0．05)．Conclusion URSA is closely related to the Th17/Treg balance．Progesterone treatment can ameliorate Th17/Treg imbalance and improve pregnancy outcome by downregulating the ratio of Th17/Treg cell number and the corresponding cytokine level．

Abortion，habitual;Progesterone;T－lymphocytes，regulatory;T－lymphocytes，helper－inducer

R 714．21

A

10．3969/j．issn．1007－9572．2015．36．009

2015－02－17;

2015－11－05)

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2012－2－029)

400016重慶市，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科

李維宏，400016重慶市，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科;E－mail:liweihong_1211@yahoo．com