楊靜，肖肖，魏潔，寇蓬，楊麗華

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，昆明 650000)

紫杉醇對(duì)宮頸癌TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的影響*

楊靜，肖肖，魏潔，寇蓬，楊麗華

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，昆明 650000)

目的 探討紫杉醇對(duì)宮頸癌TC-1細(xì)胞程序性凋亡配體1(PD-L1)表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法 ①將細(xì)胞分為紫杉醇組及紫杉醇聯(lián)合蛋白激酶D(PKD)阻斷藥(G?6976)，每組設(shè)4個(gè)濃度梯度，各5個(gè)復(fù)孔，分別加入對(duì)應(yīng)濃度試劑，MTT法檢測(cè)紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞活力的影響及G? 6976對(duì)紫杉醇IC50值的影響。②將細(xì)胞分為0.9%氯化鈉溶液組及紫杉醇組，每組5個(gè)復(fù)孔，分別加入對(duì)應(yīng)濃度試劑，免疫組化法檢測(cè)紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響。③將細(xì)胞分成陰性對(duì)照組、G? 6976組、紫杉醇組、紫杉醇聯(lián)合G? 6976組4組，每組5個(gè)復(fù)孔，分別加入對(duì)應(yīng)濃度試劑，免疫組化法檢測(cè)紫杉醇、G? 6976對(duì)TC-1細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響。 結(jié)果 紫杉醇組紫杉醇對(duì)TC-1 細(xì)胞的IC50值為40.0 μg·mL-1，紫杉醇聯(lián)合G? 6976組紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞IC50值為38.9 μg·mL-1，兩組IC50值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。紫杉醇處理TC-1細(xì)胞24 h后PD-L1的表達(dá)為(88.48±13.44)%，顯著高于陰性對(duì)照組(39.59±5.99)%(P<0.05)。紫杉醇聯(lián)合G? 6976處理TC-1細(xì)胞24 h后PD-L1表達(dá)為(79.7±4.7)%，顯著低于紫杉醇組(96.8±2.5)%(P<0.05)。 結(jié)論 紫杉醇可增加TC-1細(xì)胞PD-L1表達(dá)，阻斷PKD途徑可顯著抑制PD-L1表達(dá)增加的程度，紫杉醇可能是通過PKD途徑發(fā)揮作用。

紫杉醇；程序性凋亡配體1；蛋白激酶D；癌，宮頸

紫杉醇是宮頸癌常用的化學(xué)治療(化療)藥物[1]。腫瘤化療效果除了與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性有關(guān)外，還與機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān)，機(jī)體免疫抑制或免疫逃逸是影響化療效果的主要原因之一[2]。T淋巴細(xì)胞的一種陰性調(diào)節(jié)信號(hào)分子程序性凋亡配體(programmed death ligand-1，PD-L1)是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤免疫逃逸相關(guān)的重要分子之一[3]。PD-L1與T淋巴細(xì)胞受體表面程序性凋亡受體(programmed death-1 receptor，PD-1)結(jié)合，提供抑制性信號(hào)，導(dǎo)致T調(diào)節(jié)細(xì)胞(T regulate cells，Treg) 活性增強(qiáng)及抗腫瘤T 細(xì)胞失能，抑制T細(xì)胞的分化和增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞失能或凋亡[4]。PD-L1在慢性持續(xù)感染、腫瘤等病理情況下表達(dá)可增加，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制疾病進(jìn)展。有研究表明，內(nèi)源抗腫瘤介質(zhì)如干擾素γ(interferon-γ，INF-γ)或抗腫瘤治療誘導(dǎo)下某些腫瘤細(xì)胞可表達(dá)PD-L1，抑制T淋巴細(xì)胞活性，從而影響治療效果[5]。筆者尚未見紫杉醇對(duì)宮頸癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)影響的研究。本研究通過免疫組化研究紫杉醇對(duì)宮頸癌TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的影響及其可能機(jī)制，以期為提高宮頸癌化療效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 細(xì)胞株：鼠肺上皮細(xì)胞株TC-1，是鼠源性的人乳頭瘤病毒16(human papillomavirus 16，HPV16)陽性的腫瘤細(xì)胞株，由美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院TC WU教授惠贈(zèng)。兔抗鼠PD-L1多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)自Gibco，G? 6976購(gòu)自Sigma，紫杉醇購(gòu)自海南制藥廠，SP免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)。超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠，SPEG AIR TECH)；微量加樣器(德國(guó)Eppendorf，2.5～1 000 μL)；光學(xué)顯微鏡、倒置相差熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，24，96孔板(Costar公司 3524 3599)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Model 2550 EIA reader)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) TC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素濃度均為100 U·mL-1的DMEM培養(yǎng)液，置于 5%二氧化碳、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。常規(guī)換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞活力的影響及蛋白激酶D(protein kinases D，PKD)阻斷藥G? 6976對(duì)紫杉醇IC50值的影響 將細(xì)胞分為紫杉醇組及紫杉醇聯(lián)合G? 6976組，TC-1細(xì)胞接種于 96 孔板，每組分4個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，紫杉醇組加含紫杉醇終濃度分別為10.0，18.0，32.4，58.3 μg·mL-1的培養(yǎng)液每孔150 μL，紫杉醇聯(lián)合G? 6976組每孔均加入G? 6976 5 μmol·L-1，然后加含紫杉醇終濃度分別為10.0，18.0，32.4，58.3 μg·mL-1的培養(yǎng)液。兩組均在24 h加MTT，4 h加DMSO，振蕩、酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均A值-空白孔A值)/(對(duì)照組平均A值-空白孔A值)×100%。

1.4 紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的影響 將細(xì)胞分為0.9%氯化鈉溶液組及紫杉醇組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，紫杉醇組加入含20.0 μg·mL-1紫杉醇的培養(yǎng)液，0.9%氯化鈉溶液組加入含0.9%氯化鈉溶液的培養(yǎng)液，每孔500 μL。24 h后免疫組化方法檢測(cè)TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)。具體方法為4%多聚甲醛固定細(xì)胞，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加PD-L1多克隆抗體，4 ℃過夜后生物素化山羊抗兔二抗，室溫孵育20 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，觀察、攝像。

1.5 G? 6976對(duì)紫杉醇引發(fā)的TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)變化的影響 將細(xì)胞分成4組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照組、G? 6976組、紫杉醇組、紫杉醇聯(lián)合G? 6976組。陰性對(duì)照組加入含0.9%氯化鈉溶液和DMSO的培養(yǎng)液，G? 6976組加入含5 μmol·L-1G? 6976的培養(yǎng)液，紫杉醇組加入含20.0 μg·mL-1紫杉醇的培養(yǎng)液，紫杉醇組+G? 6976組加入含20.0 μg·mL-1紫杉醇和含5 μmol·L-1G? 6976的培養(yǎng)液，24 h后同“1.4”項(xiàng)下方法，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞活力的影響及G? 6976對(duì)紫杉醇IC50值的影響 紫杉醇組細(xì)胞的抑制率平均9.0%，10.4%，41.3%，62.5%。紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈濃度依賴性，紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞的IC50為40.0 μg·mL-1。紫杉醇聯(lián)合G? 6976組細(xì)胞的抑制率平均為9.2%，11.2%，42.1%，61.6%，紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞的IC50值為38.9 μg·mL-1。兩組IC50值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的影響 PD-L1主要表達(dá)在細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色顆?；驁F(tuán)塊，多區(qū)域分布。紫杉醇處理24 h后TC-1細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)為(88.48±13.44)%，陰性對(duì)照組為(39.59±5.99)%，與陰性對(duì)照組比較，紫杉醇處理后的TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.35，P<0.05)。見圖1。

A.陰性對(duì)照組；B.紫杉醇組

圖1 兩組TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)蘇木精-伊紅染色圖(×200)

A.negative control group；B.paclitaxel group

Fig.1 HE staining on PD-L1 expression at cell surface of TC-1 in two groups(×200)

2.3 G? 6976對(duì)紫杉醇引起的TC-1細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)變化的影響 與陰性對(duì)照組比較，紫杉醇組、紫杉醇聯(lián)合G? 6976組細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)顯著增高，而紫杉醇聯(lián)合G? 6976組與紫杉醇組比較，細(xì)胞表面

PD-L1的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.06，P<0.05)。見圖2，表1。

3 討論

PD-L1過度表達(dá)與其免疫逃逸機(jī)制相關(guān)，PD-L1表達(dá)增加，與T細(xì)胞上的PD-1受體結(jié)合增加，傳遞的負(fù)性調(diào)控信號(hào)增多，導(dǎo)致活性增強(qiáng)及抗腫瘤T 細(xì)胞的凋亡和免疫無能，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控和殺傷，產(chǎn)生免疫逃逸。慢性持續(xù)感染、腫瘤等多種病理情況可出現(xiàn)PD-L1過度表達(dá)，影響腫瘤治療效果。ZHANG等[6]報(bào)道紫杉醇、依托泊苷、5-氟尿嘧啶(5-Fu)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)增加，促進(jìn)PD-L1引起的T細(xì)胞凋亡，影響紫杉醇、依托泊苷、Fu對(duì)乳腺癌的抑制作用。QIN等[7]報(bào)道應(yīng)用順鉑后肝癌細(xì)胞株H22過度表達(dá)PD-L1 。也有多位學(xué)者報(bào)道正常宮頸組織中不表達(dá)PD-L1，宮頸癌組織中PD-L1高表達(dá)，且細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)與癌細(xì)胞浸潤(rùn)深度明顯相關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)紫杉醇使TC-1細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)增加，提示應(yīng)用紫杉醇后可增加PD-L1在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，這可能是影響紫杉醇化療效果的原因之一。

QIN等[7]認(rèn)為化療藥物順鉑使肝癌細(xì)胞上PD-L1表達(dá)增加是通過Erk /MAPK途徑。CHEN等[5]發(fā)現(xiàn)干擾素γ通過蛋白激酶D2(PKD2)途徑提高口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。研究表明，PKD與腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展、遷移都有聯(lián)系[9]。PKD家族存在于大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)，胞質(zhì)、細(xì)胞核、高爾基體及線粒體內(nèi)均有分布，在細(xì)胞間信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用[10]。在本研究中，加入PKD阻滯劑后能減少紫杉醇增加腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的增加程度，提示PKD途徑參與了紫杉醇影響腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)增加這一過程。這一結(jié)果與干擾素增加腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)相似。

A.陰性對(duì)照組；B.G? 6976組；C.紫杉醇組；D.紫杉醇+G? 6976組

表1 4組TC-1細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)的比較

與陰性對(duì)照組比較，*1P<0.05；與紫杉醇組比較，*2P<0.05

Compared with negative control group，*1P<0.05；compared with paclitaxel group，*2P<0.05，

紫杉醇能顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)中也得出了相似的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDK阻斷藥能夠顯著減少紫杉醇增加腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)程度，為了探討PDK阻斷藥是否可促進(jìn)紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞的抑制作用，用MTT法檢測(cè)了PDK阻斷藥對(duì)于紫杉醇IC50值的影響，發(fā)現(xiàn)PDK阻斷藥未能改變紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞的IC50值，說明紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞的抑制作用與PDK阻斷藥無顯著關(guān)系，提示PDK阻斷藥對(duì)于紫杉醇對(duì)TC-1細(xì)胞的影響是通過調(diào)節(jié)免疫因子，通過機(jī)體免疫效應(yīng)發(fā)揮作用的。

因此，可推測(cè)阻斷PKD途徑可能阻斷紫杉醇引起的腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)增加，抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，提高化療效果，為提高紫杉醇化療效果提供了理論依據(jù)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.010

Effect of Paclitaxel on Expression of PD-L1 in Surface of Cervical Cancer TC-1 Cells

YANG Jing, XIAO Xiao, WEI Jie, KOU Peng, YANG Lihua

(DepartmentofGynaecology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650000,China)

Objective To investigate effect of paclitaxel on expression of programmed death ligand-1 (PD-L1) in the surface of cervical cancer TC-1 cells and its mechanism. Methods ①The cells were divided into two groups： paclitaxel group, paclitaxel combined with PKD blocker (G? 6976) group.There were 4 concentration gradient and 5 holes for each group, and each hole has its corresponding concentration of drugs.Influence of paclitaxel on TC-1 cell viability and effect of PKD blocker G? 6976 on IC50value of paclitaxel were evaluated by MTT method.②The cells were divided into 0.9% sodium chloride solution (NS) group and paclitaxel group, There were 5 holes of each group.Effect of paclitaxel on PD-L1 expression on the surface of TC-1 cells were measured by immunohistochemistry.③The cells were divided into 4 groups： NS+DMSO group, G? 6976 group, paclitaxel group and paclitaxel+G? 6976 group.There were 5 holes for each group.Effect of paclitaxel and G? 6976 on PD-L1 expression on the surface of TC-1 cells were measured by immunohistochemistry.The expressions of PD-L1 on the surface of cells were measured by immunofluorescence treated with different drugs. Results The IC50value of paclitaxel was 40.0 μg·mL-1in paclitaxel group, and 38.9 μg·mL-1in paclitaxel combined with PKD blocker G? 6976 group, without significant difference between the two groups (P>0.05).The expression of PD-L1 in the surface of TC-1 cells were significantly higher in paclitaxel group than in negative control group [(88.48±13.44)%vs.(39.59±5.99)%,P<0.05].The expression of PD-L1 in the surface of TC-1 cells was (79.7%±4.7)% after treatment with paclitaxel combined with PKD blocker G? 6976 for 24 h, and it was significantly lower than that in paclitaxel group [(96.8±2.5)%,P<0.05]. Conclusion Paclitaxel promotes the expression of PD-L1 in the surface of TC-1 cells, which could be significantly inhibited by blocking PKD pathway.Paclitaxel may exert its effect through PKD pathway.

Paclitaxel；Programmed death ligand-1；Protein kinases D；Cancer, cervical

2014-09-03

2015-01-09

*云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上基金資助項(xiàng)目(2012FB162)

楊靜(1987-)，女，湖北荊州人，在讀碩士，研究方向：婦科腫瘤。電話：(0)18163138117，E-mail：olivehope@163.com。

楊麗華(1972-)，女，云南麗江人，副教授，博士，研究方向：婦科腫瘤。電話：(0)13759481789，E-mail：13759481789@163.com。

R979.1；R737.3

A

1004-0781(2015)08-1028-04