包華音，劉楊，萬鵬

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

丹參多糖提取工藝優(yōu)選與含量測定*

包華音，劉楊，萬鵬

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355)

目的 優(yōu)化丹參多糖提取工藝，測定不同產(chǎn)地丹參藥材多糖含量。方法 采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以丹參藥材中多糖含量為指標(biāo)，確定多糖提取的最佳工藝，采用苯酚-硫酸法對(duì)不同產(chǎn)地丹參藥材的多糖含量進(jìn)行測定。結(jié)果 建立了丹參藥材多糖的最優(yōu)提取工藝：加入溶劑量20倍，藥材粉末回流提取50 min，提取3次，醇沉濃度為70%。不同產(chǎn)地的丹參藥材多糖含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行，為丹參藥材多糖活性的進(jìn)一步研究和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

丹參多糖；正交實(shí)驗(yàn)；苯酚-硫酸法

丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的根，味苦，性微寒，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清熱安神的功效[1]。研究表明，丹參多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)保護(hù)活性，能減少尿蛋白的排泄，抑制血清膽固醇和脂質(zhì)過氧化物濃度的提高，改善血清清蛋白與球蛋白比值，并對(duì)小鼠急性肝損傷有顯著保護(hù)作用[2-4]。丹參多糖能明顯增加心肌細(xì)胞抗增殖蛋白(prohibitin)表達(dá)，有效保護(hù)過氧化氫(H2O2)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[5]。因此，研究丹參多糖成分在中藥資源開發(fā)和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方面具有重要意義。筆者在本研究中通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選丹參藥材多糖提取工藝，并對(duì)不同產(chǎn)地丹參藥材的多糖含量進(jìn)行測定，以期為丹參多糖的進(jìn)一步研究和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CP225D型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)，SL型恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)，TL-1型醫(yī)用離心機(jī)(姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司)，UV-9000型紫外-可見分光光度計(jì)(上海云析儀器有限公司)，101-OA型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(上海佰奧生物科技有限公司)。

1.2 試劑 95%乙醇(天津科盟化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20110427)、D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-200302，含量：99.5%)、濃硫酸(萊陽市康德化工有限公司，批號(hào)：20091210)、苯酚(上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)：W991116)均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 藥材 藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根，粉碎過四號(hào)篩(篩孔內(nèi)徑<250 μm)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制 取D-葡萄糖對(duì)照品100.00 mg精確稱定，加水溶解并定容至100 mL，得對(duì)照品溶液(葡萄糖濃度為1.000 0 mg·mL-1)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液0，20，40，60，80，100 μL于具塞試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，各加入6%的苯酚溶液1.0 mL，混勻。迅速加入濃硫酸5.0 mL混勻，放置5 min。將試管置于沸水浴中15 min，取出冷至室溫。以第1支試管中溶液為空白對(duì)照，按照分光光度法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄VA)，在490 nm波長處測定其余5支試管中溶液的吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y=0.016 2X-0.003 4(r=0.999 1)，線性范圍0～100 μg。

2.3 多糖提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)選取4個(gè)影響因素：料液比(A)、醇沉濃度(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，選用L9(34)正交表，以多糖含量為指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1。

表1 丹參藥材多糖提取工藝優(yōu)選因素L9(34)水平表

水平料液比(A)/倍醇沉濃度(B)/%提取時(shí)間(C)/min提取次數(shù)(D)111060501212070702313080903

2.4 供試品溶液的配制 向丹參藥材粉末中加入A倍量水并稱定?；亓魈崛(min)，室溫冷卻后稱定并補(bǔ)足失質(zhì)量，過濾。向藥渣中加入A倍量水重復(fù)回流提取D次。合并濾液，濃縮至初始水溶液體積。精密吸取濃縮液2 mL，加入95%乙醇至溶液乙醇濃度為B，混勻，靜置1 h。4 000 r·min-1離心10 min，將沉淀用1 mL水溶解。向溶液中加入Sevag試劑(三氯甲烷：正丁醇= 4：1)2 mL，混勻，4 000 r·min-1離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)至刻度試管中，加水補(bǔ)至2 mL，混勻得供試品溶液。

2.5 最佳提取工藝確定 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果

A：料液比；B：醇沉濃度；C：提取時(shí)間；D：提取次數(shù)

表3 方差分析表

從表3可見，F(xiàn)A=39.520，F(xiàn)B=8.508，F(xiàn)D=4.442，均P<0.05。按a=0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，可認(rèn)為因素A、B、D均有顯著性，為主要影響因素；FC=1.002，P﹥0.05，因此因素C無顯著性，為次要影響因素。結(jié)合表2數(shù)據(jù)，A、B、D均數(shù)估計(jì)取最高者，由于因素C無顯著性，所以在經(jīng)濟(jì)的條件下選擇提取時(shí)間最少者，得最佳提取工藝為A2B2C1D3，即溶劑量為20倍，醇沉濃度為70%，回流提取50 min，提取3次。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液40 μL，加水補(bǔ)至2.0 mL，按照“2.2”項(xiàng)中的方法制備待測液，并測定吸光度。重復(fù)操作6次，RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)確定的提取工藝制備供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下方法于5，10，15，20，25，30 min時(shí)測定吸光度，RSD=1.11%，結(jié)果表明供試品溶液在30 min內(nèi)測定穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)確定的提取工藝制備供試品溶液，平行處理6份，每份2.0 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法測定吸光度。RSD =1.41%，結(jié)果表明樣品測定符合技術(shù)要求，重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取丹參樣品6份各3.000 0 g，各加入葡萄糖對(duì)照品5.5 mg，按照“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測定吸光度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。平均加樣回收率96.32%，RSD=1.14%(n=6)，加樣回收率符合技術(shù)要求。

表4 葡萄糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照篩選出的最佳提取工藝，提取3批樣品進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中以葡萄糖計(jì)的總多糖含量(mg·g-1)，分別為1.493 8，1.512 3，1.524 7，RSD為1.19%，結(jié)果表明此工藝穩(wěn)定、可行。

2.11 不同產(chǎn)地丹參藥材多糖的含量測定 按“2.4”項(xiàng)下方法，根據(jù)確定的提取工藝分別制備不同產(chǎn)地丹參藥材的供試品溶液，平行處理3份，每份2.0 mL，按“2.2”項(xiàng)方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出藥材中的多糖含量。結(jié)果見表5。

從表5可見，本研究中不同產(chǎn)地丹參多糖含量存在一定差異，含量高低順序?yàn)椋宏兾髀迥?河南南陽>山東平邑>山東沂源>河南盧氏>山東煙臺(tái)>山東煙臺(tái)航天>山東蒙陰>山東臨朐。其中，陜西洛南的多糖含量最高，為1.83 mg·g-1，是山東臨朐多糖含量的1.5倍。

3 討論

經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)比較，回流提取的丹參多糖含量顯著高于超聲提取，因此本研究采用回流方式提取丹參多糖。

通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出丹參藥材中多糖的提取工藝為：以20倍量的水回流提取藥材粉末50 min，提取3次，合并提取液濃縮，乙醇醇沉濃度70%。該工藝能更加準(zhǔn)確地反映丹參藥材中多糖的含量，減少測定誤差。

表5 不同產(chǎn)地丹參藥材的多糖含量n=3

水提醇沉法是利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)提純多糖工藝成本低、安全，目前在多糖提取中廣泛應(yīng)用[6]。但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)等成分提取出來，因此本研究中選擇用Sevag法去除蛋白質(zhì)[7]。

研究表明，蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性較差，而苯酚-硫酸法較為穩(wěn)定，是較為理想的多糖含量測定方法[8]。本研究采用苯酚-硫酸法對(duì)多糖含量進(jìn)行測定，簡單、快捷、靈敏，經(jīng)過方法學(xué)考察，測定結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

丹參多糖具有提高免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長、抗疲勞、降血脂等多種生物活性[9-10]，具有廣闊的研究和開發(fā)前景，對(duì)丹參藥材的多糖含量進(jìn)行測定在丹參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方面具有重要意義。本研究中不同產(chǎn)地丹參藥材中多糖含量不同，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與丹參為我國常用大宗藥材之一，具有完善的栽培加工技術(shù)有關(guān)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.032

2013-11-03

2014-01-20

*山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題(2011LZ01-03)

包華音(1979-)，女，山東榮成人，副教授，博士，研究方向：中藥質(zhì)量控制與資源研究。E-mail：baohuayin@163.com。

萬鵬(1961-)，男，山東濟(jì)南人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：生藥學(xué)。E-mail：wanpeng0429@163.com。

R286；TQ460.1

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1004-0781(2015)03-0404-03