李海濤，何薇，周鵬，陳凱彪，董燕紅

(1.國(guó)家海洋局 南海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，廣東 廣州 510300)

伶鼬榧螺(Olivamustelina)的分子鑒定及其形態(tài)變異

李海濤1，何薇1，周鵬1，陳凱彪1，董燕紅1

(1.國(guó)家海洋局 南海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，廣東 廣州 510300)

根據(jù)榧螺螺旋部的差異可將其分為兩種不同的形態(tài)類型，類型Ⅰ(Morphotype Ⅰ)的個(gè)體螺旋部陷入體螺層中，其殼頂與前部數(shù)螺層愈合；類型Ⅱ(Morphotype Ⅱ)的個(gè)體螺旋部高出殼頂，縫合線明顯，此類型可明確鑒定為伶鼬榧螺(Olivamustelina)。本研究通過(guò)線粒體COⅠ和16S rRNA基因序列的分析對(duì)兩種形態(tài)類型的榧螺進(jìn)行了分子鑒定。結(jié)果表明：兩種形態(tài)類型的榧螺含有共享的單倍型；不同形態(tài)類型間的遺傳距離和同一形態(tài)類型內(nèi)的遺傳距離重疊；兩者的單系性在系統(tǒng)發(fā)育分析中沒(méi)有得到顯現(xiàn)，而是共同構(gòu)成一個(gè)單系。因此，兩種形態(tài)類型的個(gè)體均為伶鼬榧螺。類型Ⅰ可能是伶鼬榧螺中一種少見(jiàn)的有別于典型個(gè)體的形態(tài)變異類型。

伶鼬榧螺；COⅠ基因；16S rRNA基因；形態(tài)變異

1 引言

榧螺屬(Oliva)隸屬于新腹足目(Neogastropoda)榧螺科(Olividae)，是一類具有美麗外殼的貝類。榧螺屬的貝殼具有一定的藥用價(jià)值，有清燥潤(rùn)肺、平膽潛陽(yáng)之功效，主治高血壓、青盲內(nèi)障、骨蒸勞熱等[1]。近年來(lái)，由于野生資源衰竭，部分榧螺種類已處于瀕危狀態(tài)[2]。

伶鼬榧螺(Olivamustelina)是南海沿岸水域較為常見(jiàn)的種類，也是榧螺屬最主要的入藥種類。典型的伶鼬榧螺其螺旋部高出殼頂，且縫合線明顯。但在自然界中也存在另外一類個(gè)體，其貝殼花紋與伶鼬榧螺相似，但螺旋部陷入體螺層中，殼頂與前部螺層愈合。這兩種形態(tài)類型的差別屬于種內(nèi)還是種間變異，尚未得到其他研究的證實(shí)。

由于缺乏肋紋等特征，貝殼的顏色和花紋目前仍是榧螺屬分類最重要的依據(jù)。但這類特征也常發(fā)生變異，Bert[3]描述了一類殼色發(fā)生變異的伶鼬榧螺個(gè)體，其淺棕色的貝殼上伴有縱向的青灰色斑紋，明顯有別于正常個(gè)體的“之”字形花紋。形態(tài)可塑性為分類學(xué)家?guī)?lái)極大困難，使其難以區(qū)分種內(nèi)和種間變異的界限。

分子生物學(xué)的發(fā)展提供了一種新的物種鑒定手段。線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(cytochromecoxidase subunit Ⅰ，COⅠ)和16S rRNA基因已在貝類的物種鑒定中得到廣泛應(yīng)用[4-7]。本研究旨在通過(guò)線粒體COⅠ和16S rRNA基因序列的分析來(lái)鑒別兩種不同形態(tài)的榧螺，以期為資源的開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)，以及其他學(xué)科的研究提供基礎(chǔ)資料。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的榧螺標(biāo)本采自珠江口及汕頭南澳島海域(表1)，腹足肌以90%酒精或-80℃冰凍保存。榧螺標(biāo)本的殼色和花紋相似，但依據(jù)螺旋部的差異可分為2種不同的形態(tài)類型：類型Ⅰ(Morphotype Ⅰ)個(gè)體的螺旋部陷入體螺層(圖1a，1b)，螺旋部的所有螺層愈合(圖1c)；類型Ⅱ(Morphotype Ⅱ)個(gè)體的螺旋部高出殼頂，縫合線明顯(圖1d，1e)，螺旋部的螺層不愈合(圖1f)，此類型的個(gè)體可鑒定為伶鼬榧螺。共選取兩種形態(tài)類型的31個(gè)個(gè)體用于形態(tài)學(xué)測(cè)量分析，其中24個(gè)用于分子生物學(xué)分析(表1)。

圖1 兩種不同形態(tài)類型榧螺的貝殼Fig.1 Shells of two Morphotypes of Oliva species

表1 用于DNA序列分析的榧螺標(biāo)本信息

Tab.1 Specimen information ofOlivaspecimens used for DNA sequence analyses

形態(tài)類型標(biāo)本采集時(shí)間采集地點(diǎn)GenBank登錄號(hào)單倍型COⅠ16SrRNACOⅠ16SrRNAMorphotypeⅠXD?12010年4月珠江口KF186640KF186631H1L1MorphotypeⅠXD?22010年4月珠江口KF186632L2MorphotypeⅠXD?32010年4月珠江口KF186641KF186631H2L1MorphotypeⅠXD?42013年3月南澳島KF186642KF186631H3L1MorphotypeⅡLY?22010年4月珠江口KF186631L1MorphotypeⅡLY?62013年3月南澳島KF186643KF186633H4L3MorphotypeⅡLY?72013年3月南澳島KF186644KF186634H5L4

續(xù)表1

2.2 貝殼形態(tài)數(shù)據(jù)的測(cè)量和分析

用游標(biāo)卡尺(精度0.2 mm)測(cè)量?jī)煞N形態(tài)類型榧螺標(biāo)本的殼高(SL)和殼寬(SW)，比較兩種形態(tài)類型的SL及殼高與殼寬之比(SL/SW)的差異。

2.3 模板DNA制備、PCR擴(kuò)增和序列分析

采用堿裂解法制備模板DNA，具體步驟為：剪取小塊腹足肌，去離子水清洗兩次，吸干水分后置于180 μL 0.05 mol/L NaOH溶液中，95℃消化15 min，然后加入20 μL 1 mol/L Tris-Cl(pH7.6)，混勻后10 000 r/min離心10 min，上清液作為模板使用。用于擴(kuò)增COⅠ基因的引物為L(zhǎng)CO-1490(5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′)和LCO-2198 (5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′)[8]；擴(kuò)增16S rRNA基因的引物為16sar-L(5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3′)和16sbr-H(5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′)[9]。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中：2×buffer 25 μL，dNTP 400 μmol/L，引物各0.3 μmol/L，KOD FX高保真PCR酶(TOYOBO公司)1.0 U，模板DNA1.2 μL，加去離子水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性15 s，52℃退火30 s，68℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收純化，然后進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同。

將所測(cè)的序列與GenBank和國(guó)際生命條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)BOLD Systems中查得的其他榧螺屬序列一起用DAMBE(Version 5.2.65)軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。使用MEGA 5.10軟件計(jì)算變異位點(diǎn)、堿基組成和基于Kimura 雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter，K2P)下各個(gè)類群內(nèi)部及類群之間的遺傳距離，并利用該軟件中的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)和非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean，UPGMA)構(gòu)建所有單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可靠性經(jīng)過(guò)1 000次自展(Bootstrap)檢驗(yàn)。采用DNASP 5.10軟件計(jì)算單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)的分析

從貝殼的SL及SL/SW比值來(lái)看，兩種形態(tài)類型的榧螺是大范圍重疊的，通過(guò)SL/SW比值無(wú)法將兩者明確區(qū)分(見(jiàn)表2)。

表2 兩種不同形態(tài)榧螺貝殼的形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)

3.2 線粒體基因的序列分析

共成功獲得22條COⅠ基因序列，各序列長(zhǎng)度均為658 bp(不含引物區(qū))，無(wú)插入/缺失位點(diǎn)，A、T、G、C的平均含量分別為23.4%、39.1%、20.5%和17.0%，A+T的含量明顯高于G+C的含量。22條COⅠ基因序列定義了18種單倍型(H1～H18，GenBank登錄號(hào)KF186640～KF186657)。其中，1個(gè)Morphotype Ⅰ個(gè)體(XD-3)和2個(gè)Morphotype Ⅱ個(gè)體(LY-13和LY-19)共享單倍型H2。

在COI基因序列上共檢測(cè)到52個(gè)變異位點(diǎn)(22個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn))，占核苷酸總數(shù)的7.9%，其中46個(gè)發(fā)生在密碼子第三位堿基，6個(gè)發(fā)生在密碼子第一位堿基。所有核苷酸的變異未導(dǎo)致氨基酸序列的變化。MorphotypeⅠ個(gè)體間的遺傳距離為0.019～0.025，Morphotype Ⅱ個(gè)體間的遺傳距離為0～0.028，兩種形態(tài)類型之間的遺傳距離為0～0.026，同一形態(tài)類型內(nèi)及兩種形態(tài)類型間的遺傳距離完全重疊，無(wú)明顯的界限。上述兩種形態(tài)的個(gè)體與其他榧螺，如O.spicata(GenBank登錄號(hào)FM999165)、O.sayana(GenBank登錄號(hào)U86333)、O.amalda(BOLD序列號(hào)NEOGA900-10、NEOGA901-10和NEOGA902-10)、Olivasp.(BOLD序列號(hào)NEOGA879-10)、Olivasp.1(BOLD序列號(hào)NEOGA877-10)間的遺傳距離較大，在0.129～0.241之間。

共成功獲得18條16S rRNA基因序列，其長(zhǎng)度為508～510 bp，存在2個(gè)位點(diǎn)的插入/缺失。A、T、G、C的平均含量分別為34.5%、29.5%、19.9%和16.1%，A+T的含量顯著高于G+C的含量。18條16S rRNA基因序列共定義了9種單倍型(L1～L9，GenBank登錄號(hào)KF186631～KF186639)。其中，2個(gè)Morphotype Ⅰ個(gè)體和8個(gè)Morphotype Ⅱ個(gè)體共享單倍型L1，這一單倍型序列與來(lái)自日本Ise bay的一條伶鼬榧螺序列[10](GenBank登錄號(hào)AB121038)完全相同。

在16S rRNA基因序列上共檢測(cè)到10個(gè)變異位點(diǎn)，占核苷酸總數(shù)的2.0%，其中4個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。兩種形態(tài)類型內(nèi)的遺傳距離分別為0～0.008和0～0.012，兩種形態(tài)類型間的遺傳距離為0～0.014，形態(tài)類型內(nèi)和形態(tài)類型間的遺傳距離完全重疊。而它們與O.spicata(FM999114)間的遺傳距離則高達(dá)0.104～0.112。

基于COⅠ基因序列計(jì)算的單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別為Hd=(0.974±0.024)和Pi=(0.015 5±0.001 1)；基于16S rRNA基因序列計(jì)算的結(jié)果分別為Hd=(0.706±0.120)和Pi=(0.003 6±0.001 0)。單倍型多樣性指數(shù)高于核苷酸多樣性指數(shù)，且COⅠ基因所反映的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均高于16S rRNA基因。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于COⅠ和16S rRNA 基因序列分別構(gòu)建了NJ樹(shù)和UPGMA樹(shù)，兩種樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。因此本文僅給出NJ樹(shù)，其自展支持率(僅大于70%的列出)標(biāo)注在節(jié)點(diǎn)斜線左側(cè)，UPGMA樹(shù)的自展支持率標(biāo)注在節(jié)點(diǎn)斜線右側(cè)。

基于COⅠ基因序列構(gòu)建的NJ樹(shù)(見(jiàn)圖2)顯示，18個(gè)單倍型合在一起形成一個(gè)單系，支持率為99%，在系統(tǒng)樹(shù)中處于較為進(jìn)化的位置。兩種形態(tài)類型榧螺的單系性在系統(tǒng)樹(shù)上均沒(méi)有得到顯現(xiàn)，相互間無(wú)法明確區(qū)分。

在基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的NJ樹(shù)(見(jiàn)圖3)中，9個(gè)單倍型與GenBank中的一條伶鼬榧螺序列(GenBank登錄號(hào)AB121038)共同形成一個(gè)單系群，支持率為99%。兩種形態(tài)類型的單系性也未在系統(tǒng)樹(shù)上得到顯現(xiàn)。

4 討論

貝殼的形態(tài)受多種生物和非生物因素的影響，因此僅依據(jù)貝殼形態(tài)來(lái)進(jìn)行分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究越來(lái)越有爭(zhēng)議性[11]。腹足類的個(gè)體差異、性別差異和以及發(fā)育階段的不同均可能導(dǎo)致貝殼形態(tài)特征的變化[7]。

圖2 基于COⅠ基因序列通過(guò)鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Molecular phylogenetic tree based on COⅠ gene sequences using Neighbor-joining method

圖3 基于16S rRNA基因序列通過(guò)鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Molecular phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences using Neighbor-joining method

基于線粒體COⅠ和16S rRNA 基因序列的分析結(jié)果表明兩種形態(tài)類型的榧螺之間沒(méi)有明顯的遺傳差異：兩者享有共同的單倍型；遺傳距離完全重疊；各自無(wú)法形成單系，而是共同形成一個(gè)單系群，且獲得很高的支持率。因此，兩種類型的個(gè)體為同一物種，即伶鼬榧螺。COⅠ基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼序列，在種內(nèi)沒(méi)有發(fā)生堿基的插入/缺失，其變異也未造成氨基酸序列的改變。COⅠ基因的進(jìn)化速率較16S rRNA基因更快，本文的研究結(jié)果與其他研究結(jié)論[4，12]是一致的。COⅠ基因所揭示的伶鼬榧螺單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均明顯高于16S rRNA基因。

榧螺屬的分類問(wèn)題由來(lái)已久，其現(xiàn)生種的拉丁學(xué)名達(dá)500多個(gè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)實(shí)際的種類數(shù)，同種異名現(xiàn)象十分嚴(yán)重[13]。殼頂是否陷入體螺層是伶鼬榧螺與陷頂榧螺(O.concavospira)的形態(tài)區(qū)別之一，但伶鼬榧螺中也存在螺旋部陷入體螺層的個(gè)體，且其螺旋部的螺層常愈合在一起。因此，這些特征在用于屬下種間的鑒別時(shí)需要十分慎重，也不宜作為亞種區(qū)分的依據(jù)。Bert[3]描述的有別于典型伶鼬榧螺形態(tài)的個(gè)體除顏色和花紋不同之外，其螺旋部也明顯低矮。本研究中的Morphotype Ⅰ個(gè)體也可能是伶鼬榧螺中一種較為少見(jiàn)的形態(tài)變異類型，這類個(gè)體在采集標(biāo)本中的數(shù)量不多。

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Molecular identification ofOlivamustelinaand its morphological variation

Li Haitao1，He Wei1，Zhou Peng1，Chen Kaibiao1，Dong Yanhong1

(1.SouthChinaSeaEnvironmentalMonitoringCenter，StateOceanicAdministration，Guangzhou510300，China)

Based on the morphologic difference of spire，Olivasnails with similar shell colors and patterns can be divided into two morphotypes. Morphotype Ⅰ is characterized by the sunk spire in its concavity below the shoulder of the body whorl and the whorls of spire fused together. Morphotype Ⅱ shows the identical conchological characteristics of typical specimens ofO.mustelina. The mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ (COⅠ) and 16S rRNA gene segments of these two morphotypes were sequenced. Genetic analyses clearly showed many common haplotypes and lack of significant genetic differentiation between the two morphotypes. In addition，further phylogenetic analyses showed that all haplotypes were grouped in a monophyletic clade. Thus，the two morphotypes are not genetically diagnosable，and therefore should be assigned to speciesO.mustelina. Morphotype Ⅰ may be a new form ofO.mustelinathat differ from the typical specimens．

Olivamustelina; COⅠ gene; 16S rRNA gene; morphological variation

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.04.011

2014-06-04；

2015-01-03。

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201305010，201105003)；南海區(qū)海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)方法(DOMEP(MEA)-01-03)。

李海濤(1981—)，男，湖北省沙洋縣人，主要從事貝類分類學(xué)研究。E-mail:haitaoli1981@126.com

Q959.212

A

0253-4193(2015)04-0117-07

李海濤，何薇，周鵬，等. 伶鼬榧螺(Olivamustelina)的分子鑒定及其形態(tài)變異[J].海洋學(xué)報(bào)，2015，37(4)：117—123，

Li Haitao，He Wei，Zhou Peng，et al. Molecular identification ofOlivamustelinaand its morphological variation[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(4)：117—123，doi: 10.3969/j.issn.0253-4193.2015.04.011