劉小丹, 董繼勝, 姬鐵強, 楊培龍

1.黑龍江迪龍制藥有限公司, 黑龍江 安達 151400;

2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術重點實驗室, 北京 100081

一種來源于Brachybacteriumsp. DB5的α-半乳糖苷酶克隆及性質(zhì)研究

劉小丹1,2, 董繼勝1, 姬鐵強1, 楊培龍2*

1.黑龍江迪龍制藥有限公司, 黑龍江 安達 151400;

2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術重點實驗室, 北京 100081

α-半乳糖苷酶是一種有著巨大商業(yè)價值的工業(yè)酶制劑，在醫(yī)藥、食品和化工等行業(yè)有著廣泛的應用。以來源于雪蓮根部土壤的短狀桿菌Brachybacteriumsp. DB5為材料，從其基因組中擴增出一個α-半乳糖苷酶基因編碼序列，經(jīng)過測序及BLAST比對分析，證實該基因?qū)儆讦?半乳糖苷酶。將其與pET-30a(+)載體相連后在大腸桿菌中進行異源表達，經(jīng)過誘導獲得了此酶的胞外高效表達，粗酶液的活性為5.07 U/mL，經(jīng)純化后酶的活性達72.78 U/mL，酶學特性分析表明其最適pH為6.0，最適溫度為40℃。此酶可用作動物飼料豆粕的添加劑，以提高飼料的利用率。

α-半乳糖苷酶;短狀桿菌;基因克隆;表達;性質(zhì)

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22)是一種外切糖苷酶，在動植物、人和微生物體內(nèi)廣泛存在。它可以專一性水解催化多種寡糖、糖脂等非還原性糖鏈末端的α-半乳糖殘基，其中包括人B型血抗原[1]。

通常，在豆類飼料中(如大豆籽實和豆粕中)添加α-半乳糖苷酶，可以減少動物胃腸脹氣，提高飼料的利用率[2]。另外，α-半乳糖苷酶在醫(yī)藥、食品和化工行業(yè)中也有廣泛的應用[3]。在醫(yī)藥行業(yè)，α-半乳糖苷酶可用以治療Fabry疾病[4]。微生物來源的α-半乳糖苷酶具有易控制、高產(chǎn)、價廉等優(yōu)點，是近年來國內(nèi)外研究的熱點。目前，在多種微生物中都克隆到了α-半乳糖苷酶基因，并已經(jīng)實現(xiàn)了重組基因的高效表達[5]。

本研究通過對α-半乳糖苷酶核苷酸序列的比較，設計了一對簡并引物，利用PCR技術，建立了一種快速篩選α-半乳糖苷酶編碼基因的方法。并在原核系統(tǒng)進行表達且對表達產(chǎn)物的酶學性質(zhì)進行了初步研究，為進一步通過蛋白質(zhì)定向改造該酶的最適pH、作用溫度及酶活性，構建高產(chǎn)α-半乳糖苷酶的基因工程菌株打下堅實基礎，以便其產(chǎn)業(yè)化推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料

短狀桿菌(Brachybacteriumsp. DB5)、大腸桿菌(Escherichia.coli)BL21(DE3)、大腸桿菌(E.coli)TOP10、pET-30a(+)載體均為中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所楊培龍課題組保存或構建[6]。pEASY-T3購自全式金公司。各種限制性內(nèi)切酶、連接酶和Taq酶購自TaKaRa公司。蜜二糖、棉子糖、水蘇糖購自Sigma公司。其余為國產(chǎn)分析純。引物合成和測序由北京三博遠志公司完成。

1.2 方法

1.2.1 α-半乳糖苷酶基因片段的克隆

提取短狀桿菌菌株DB5的基因組DNA[7]。根據(jù)已分離的α-半乳糖苷酶基因保守區(qū)域特點，設計特異性引物：RP4：5′-GAYGAYGGNTGGTTYGGN-3′；RPr8：5′-GACCATYTCNGGYTCNA-MCC-3′。采用TD-PCR程序[8]，擴增基因片段并測序?；蚪MDNA作為模板進行擴增，體系(50 μL)為:10×Buffer (Mg2+)5 μL,2.5 mmol/L dNTP mix 4 μL,5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5 μL,100 μmol/L上、下游引物(上游特異性引物RP4和下游引物RPr8)各1.5 μL, 模板DNA(50 ng/μL)1 μL,ddH2O 36.5 μL。TD-PCR擴增條件：94℃預變性4 min；94℃ 25 min，58～48℃ 25 s，72℃ 1 min，10個循環(huán)；然后進入第二個循環(huán)程序：94℃ 25 min，48℃ 25 s，72℃ 1 min，20個循環(huán)；72℃ 5 min。

1.2.2 α-半乳糖苷酶TAIL-PCR擴增基因全長 根據(jù)DB5已獲得的α-半乳糖苷酶基因片段，采用Tail-PCR方法獲得基因全長[9]，所設計的特異引物見表1。所獲得的基因命名為aga-DB5。

1.2.3aga-DB5與表達載體pET-30a(+)連接 插入的基因位點采用EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點，表達引物為：DB5gaU:5′-CAGGAATTCGTGACCGCGCCCCGGCC-3′(劃線為EcoRⅠ位點)；DB5gaD:5′-ATAGCGGCCGCTCAGGAGATCGCC-GCAGAGCTG-3′(劃線為NotⅠ位點)。將aga-DB5基因克隆到表達載體中，經(jīng)測序表明克隆正確，與讀碼框相符，預測蛋白被準確表達。把該重組酶命名為aga-DB5-H。PCR再擴增反應體系(50 μL)為：10×Buffer 5 μL, 2.5 mmol/L dNTP mix 4 μL, 2.5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5 μL,20 μmol/L上、下游引物各1 μL,DB5基因組模板(10 ng/μL)1 μL,ddH2O 37.5 μL。反應條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 3.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

表1 Tail-PCR引物

1.2.4 重組酶aga-DB5-H的誘導表達和純化 挑取轉(zhuǎn)化后的陽性菌按常規(guī)方法進行搖瓶培養(yǎng), 當OD600為0.6時，加IPTG使其終濃度為1 mmol/L誘導表達。在12 h取樣，粗測酶活為胞外表達，通過膜包和超濾濃縮菌液。利用重組酶融合的6his-tag標簽，選擇鎳柱純化為純蛋白。

1.2.5 重組酶aga-DB5-H的SDS-PAGE分析 取1 mL酶液，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液100℃煮5 min, 取15 μL用于10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.6 pH和溫度對重組酶aga-DB5-H的影響 酶活性測定方法采用pNPG法[10]。在37℃，pH 2.0～11.0的條件下，經(jīng)純化的重組酶aga-DB5-H進行酶促反應以測定其最適pH，緩沖液為pH 2.0～8.0的0.1 mol/L McIlvaine緩沖液和pH 9.0～11.0的0.1 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液。再將酶液于37℃，pH 2.0～11.0的緩沖液中處理30 min，測定其酶活并研究酶的pH穩(wěn)定性。最適溫度的測定為在最適pH的條件下，溫度為0～70℃下進行酶促反應。溫度穩(wěn)定性測定是在不同溫度下處理30 min，再進行酶活測定。然后繪制最適曲線。

1.2.7 化學試劑或離子對重組酶aga-DB5-H的影響 在不同的金屬離子或化學試劑的酶促反應體系中，使加入物質(zhì)的終濃度為1 mmol/L或5 mmol/L，在37℃、pH 6.0下，保溫30 min，以空白作為對照，研究不同物質(zhì)對酶活性的影響[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-半乳糖苷酶基因序列分析

測序結(jié)果表明，來源于短狀桿菌Brachybacteriumsp. DB5的α-半乳糖苷酶基因，全長2 271 bp，編碼756個氨基酸和一個終止密碼子。其與基因組測序的BrachybacteriumfaeciumDSM 4810來源的α-半乳糖苷酶基因最高序列相似性為81%。將重組酶命名為aga-DB5-H，其理論分子量為82 kDa。通過BLAST比對，酶蛋白與BrachybacteriumfaeciumDSM 4810的α-半乳糖苷酶 (Genbank accession No.: WP012804378 )存在最高的相似性為77.%。證實其為一種新的GH36家族α-半乳糖苷酶。

2.2 表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析

基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，誘導表達，其粗酶液的表達效價可達5.07 U/mL，經(jīng)過鎳柱純化后，純酶的比活為72.78 U/mL。重組酶經(jīng)SDS-PAGE得到單一條帶，由圖1可知，分子量約為82 kDa，與預測分子量相近。蛋白條帶經(jīng)LC-ESI-MS/MS二級質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示其中3段內(nèi)肽，F(xiàn)1:RDDTTGLGDW，F(xiàn)2:VSVVLDVTDGR，F(xiàn)3:FRAASAVFG，與蛋白推測序列一致，表明a-半乳糖苷酶基因有效表達。

圖1 重組酶aga-DB5-H的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant aga-DB5-H.

2.3 pH和溫度對α-半乳糖苷酶的影響

最適pH、pH穩(wěn)定性、最適作用溫度及熱穩(wěn)定性結(jié)果見圖2。由圖2A可知，該酶的最適作用pH為6.0， pH 3以下和pH 9以上沒有檢測到酶活；在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)aga-DB5-H能有75%以上的酶活(圖2B)，證明其pH穩(wěn)定性良好。由圖2C可知，aga-DB5-H的最適作用溫度為40℃，在40℃下處理5min酶活基本不變，處理30 min后還能保持75%以上的活性(圖2D)。50℃處理酶活逐漸下降，但總的說來耐熱性較好。

圖2 pH和溫度對重組酶aga-DB5-H活性的影響Fig.2 Effect of pH and temperature on activity of recombinant aga-DB5-H.

2.4 金屬離子及化學試劑對重組酶aga-DB5-H的影響

不同濃度的金屬離子及化學試劑對重組酶aga-DB5-H酶活的影響結(jié)果見表2。從表2中可以看出，金屬離子或化學試劑濃度為1mmol/L時，除Ag+、Hg2+和陰性表面活性劑SDS完全抑制aga-DB5-H的酶活外，aga-DB5-H在大部分金屬離子和化學試劑中都表現(xiàn)出較好的酶活性。隨著溶液濃度的升高，只有EDTA和Pb2+對酶活有不同程度的促進作用，而其他離子和化學試劑在高濃度下則對酶活有不同程度的抑制作用。

2.5 底物降解能力

Aga-DB5-H酶對天然底物的降解能力結(jié)果如表3所示，研究發(fā)現(xiàn)隨著單位酶的增加降解能力增強，蜜二糖在3個單位酶的作用下能夠完全降解，其最適底物為蜜二糖。對棉子糖和水蘇糖都有一定的水解能力。降解水蘇糖的能力比棉籽糖強。因此，分解天然底物的能力為蜜二糖>水蘇糖 >棉子糖。

表2 金屬離子及相關化學試劑對重組酶aga-DB5-H的影響

表3 Aga-DB5-H對不同底物的降解能力

3 討論

本研究以PCR的方法成功獲得了來源于短狀桿菌屬微生物的α-半乳糖苷酶基因aga-DB5,并成功地將aga-DB5克隆到pET-30a(+)質(zhì)粒中，實現(xiàn)了異源高效表達。重組菌經(jīng)IPTG誘導6 h后的菌液α-半乳糖苷酶活力達到5.07 U/mL，經(jīng)純化后酶的活性為72.78 U/mL，提高了13倍。動物飼料豆粕中含有棉籽糖和水蘇糖，棉子糖和水蘇糖是含 α-半乳糖苷的主要抗營養(yǎng)因子[12]，該酶對天然底物蜜二糖、棉子糖和水蘇糖均有降解能力。因此，該酶為一種全新的可以在豆粕中添加的α-半乳糖苷酶，可以提高飼料的利用率，節(jié)約養(yǎng)殖成本，增加養(yǎng)殖業(yè)的效益。據(jù)報道重組α-半乳糖苷酶可有效地將B型紅細胞改造成O型紅細胞，并且酶解過程是在pH 5～6的情況下進行的，酶解前后都需要改變pH[13]，重組酶aga-DB5-H的最適作用pH為6.0，最穩(wěn)定的pH范圍為5.0～10.0，能保持75%以上的酶活，特別適合將B型紅細胞改造成O型紅細胞。此酶為B-O血型改造提供了更有效的工具酶。綜上可以看出，該重組酶在飼料和醫(yī)藥行業(yè)上都有廣泛的應用，值得商業(yè)開發(fā)和利用。

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Studies on the Gene Cloning and its Characterization of α-Galactosidases fromBrachybacteriumsp. DB5

LIU Xiao-dan1,2, DONG Ji-sheng1, JI Tie-qiang1, YANG Pei-long2*

1.HeilongjiangDilongPharmaceuticalCo.Ltd,HeilongjiangAnda151400,China;

2.FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSiences,Beijing100081,China

Alpha- galactosidase is a kind of industrial enzyme preparation with a huge commercial value, which has been widely used in medicine, food and chemical industries. A strain ofBrachybacteriumsp. DB5 was selected to isolate α- galactosidase gene by PCR. Sequencing and BLAST analysises showed that the sequence encoded a α-galactosidase. It was recombinant into the vector pET-30a(+) and transformed into the strainE.coli. α-Galactosidase gene was expressed efficiently after induction with IPTG. An expression activity 5.07 U/mL was obtained. After purification of pure, enzyme activity was 72.78 U/mL. The enzymatic analysis revealed that its optimal pH and temperature were 6.0 and 40℃, respectively. The enzyme could be used for additive of animal feed, soybean meal, in order to improve the feed utilization rate.

α-galactosidase;Brachybacteriumsp.; gene cloning; expression; characterization

2015-02-11; 接受日期：2015-05-01

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08003-002)資助。

劉小丹，工程師，碩士,研究方向為微生物基因工程。E-mail：jinian100@126.com。*通信作者：楊培龍,研究員,博士,博士生導師，主要從事飼料資源與生物技術研究。Tel:010-82106065；E-mail：yangpeilong@caas.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.04.10