梁俊仕, 許 雷

中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院, 北京 100081

不動桿菌3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆與表達

梁俊仕, 許 雷*

中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院, 北京 100081

3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)作為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的非特異性降解中間產(chǎn)物，具有抗雌激素特性，可擾亂生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)，比菊酯類農(nóng)藥遷移更廣，半衰期更長，生物毒性更大，是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在生物體中暴露的標志。通過構(gòu)建4-D菌(Acinetobactersp.)基因組文庫，混合池馴化篩選得到4-D菌中降解3-PBA的關(guān)鍵酶基因，其開放閱讀框為921 bp,編碼306個氨基酸，Genbank登錄號為KR024742。經(jīng)同源比對和酶活驗證，證實該酶為鄰苯二酚雙加氧酶。根據(jù)該ORF序列設(shè)計引物，引物兩端分別加上NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位點，以4-D菌基因組DNA為模板，成功克隆到D34基因序列。構(gòu)建表達載體pET-21b-D34并轉(zhuǎn)化進宿主大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG(0.1 mmol/L)誘導(dǎo)后，表達重組菌對3-PBA降解率為18.7%。研究結(jié)果為3-PBA污染的微生物環(huán)境修復(fù)提供了理論參考。

不動桿菌；基因組文庫；3-苯氧基苯甲酸；原核表達

3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)是一種常見的各類擬除蟲菊酯類農(nóng)藥(在全球范圍農(nóng)業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的殺蟲劑，比如氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯和芐氯菊酯等)的非特異性代謝中間產(chǎn)物。3-PBA被用作擬除蟲菊酯暴露的標志，而且研究證實3-PBA具有抗雌激素的特性，因此普遍認為3-PBA可擾亂生物體內(nèi)分泌[1]。3-PBA作為各類擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的代謝中間產(chǎn)物，其半衰期較菊酯類農(nóng)藥更長(180 d)[2]，生物毒性更大[3]。隨著傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)對擬除蟲菊酯農(nóng)藥的利用日漸增多，勢必對環(huán)境造成嚴重的次級污染。因此，對農(nóng)藥代謝中間產(chǎn)物3-PBA的生物修復(fù)研究對于改善農(nóng)藥殘留問題，加快環(huán)境修復(fù)有重要的生態(tài)意義。

菊酯類農(nóng)藥降解的第一步是在菊酯解酶的作用下生成3-苯氧基苯甲酸，然后再通過其他的酶系降解3-苯氧基苯甲酸。Maloney等[4]首次報道了降解菌降解氯菊酯的代謝產(chǎn)物3-PBA，推斷3-PBA可能的降解途徑，3-PBA最終被降解為苯酚和原兒茶酸并且徹底礦化。據(jù)之前3-PBA相關(guān)的降解研究推測，菌株經(jīng)過側(cè)面單加氧途徑降解3-PBA，但是降解途徑不明確，沒有測定到降解中間產(chǎn)物。李順鵬等[5]在研究3-PBA代謝途徑的實驗中，通過質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)2個產(chǎn)物分別為3-HBA和鄰苯二酚，綜合代謝產(chǎn)物鑒定推測出菌株降解3-PBA可能的代謝途徑，首先3-PBA在3-苯氧基苯甲酸1,2雙加氧酶作用下醚鍵斷裂生成3-HBA和鄰苯二酚，中間產(chǎn)物鄰苯二酚被繼續(xù)降解，而3-HBA則不能被降解從而不斷積累，反饋抑制降解過程。

目前對3-苯氧基苯甲酸的降解研究比較局限，研究多集中在相關(guān)降解菌的篩選和降解條件的優(yōu)化，沒有闡明其主要降解途徑及關(guān)鍵降解基因和降解酶，科研應(yīng)用價值有限。隨著擬除蟲菊酯農(nóng)藥應(yīng)用范圍的增加以及降解中產(chǎn)物的累積，得到高效降解3-PBA的關(guān)鍵基因，從而構(gòu)建能高效降解3-PBA的工程菌具有重要的環(huán)境修復(fù)意義。4-D菌為本實驗室前期篩選獲得，其可高效降解菊酯農(nóng)藥，且未發(fā)現(xiàn)中間產(chǎn)物殘留[6]，據(jù)此推測其含有降解3-PBA的基因，經(jīng)驗證4-D菌可利用3-PBA作碳源生長。本研究旨在通過基因組文庫技術(shù)和混合池篩選得到4-D菌中降解3-PBA的關(guān)鍵酶基因，闡明3-PBA的降解途徑，從而為構(gòu)建環(huán)境修復(fù)工程菌提供可行性論證。

1 材料與方法

1.1 材料

BamHⅠ、Sau3AⅠ、NdeⅠ、HindⅢ、Alkaline Phosphatase、連接酶、dNTPs和Taq酶等均購自Takara公司；基因組提取、質(zhì)粒提取、膠回收等試劑盒購自O(shè)MEGA公司；其他實驗儀器及試劑有：DNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱(上海智誠實驗設(shè)備有限公司)、搖床(中國科學院武漢科學儀器廠)、DSX-280A高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)、AUX220電子天平(SHIMADZU公司)、 移液槍(Finnpipette公司)、普通臺式離心機(德國Heraeus公司)、水平和垂直電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Gene公司)、3-苯氧基苯甲酸(Sigma公司)、IPTG(Sigma公司)、二甲基甲酰胺(MYM公司)、安捷倫1200 series高效液相色譜儀，其他無機和有機試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌株

大腸桿菌JM109、BL21(DE3)、4-D菌均為本實驗室-80℃條件下甘油保存，使用時LB平板劃線挑單克隆活化后使用，降解實驗前4-D菌株須在以3-PBA作唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中馴化傳代培養(yǎng)，使降解基因誘導(dǎo)表達。

1.3 4-D菌基因組文庫構(gòu)建

提取4-D菌基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ部分酶切，梯度試驗確定酶切時間與酶量，使酶切后DNA彌散片段集中于2.0～7.0 kb。提取質(zhì)粒pUC19，BamHⅠ完全酶切?；厥站€性載體與2.0～7.0 kb的DNA片段，16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，隨機挑選白斑驗證基因組文庫轉(zhuǎn)化效率。

1.4 混合池馴化篩選目的片段

用LB培養(yǎng)基將所構(gòu)建文庫平板上的白色菌落洗脫，將洗脫的重組子在含氨芐青霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基37℃，200 r/min培養(yǎng)2 h，取1 mL 混合菌液于-70℃保存，即為一個混合池，將所構(gòu)建文庫的所有陽性克隆洗脫以混合池的形式短期保存。取1 mL混合池菌液，5 000 r/min離心5 min收集菌體，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗菌泥，5 000 r/min離心5 min沉淀，重復(fù)一次，將清洗過的菌體用基礎(chǔ)培養(yǎng)基復(fù)溶至OD600=0.6～0.8，3%接菌量至3-PBA篩選培養(yǎng)基(氨芐青霉素抗性)，其中3-PBA終濃度為100 mg/L，37℃，200 r/min培養(yǎng)。根據(jù)混合池在3-PBA篩選培養(yǎng)基的生長情況，將生長狀況良好的混合池繼續(xù)以5%接菌量轉(zhuǎn)接至無機鹽培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)，馴化2～3代后取菌液劃線至3-PBA無機鹽篩選平板上培養(yǎng)，篩選能夠利用3-PBA作唯一碳源的重組子。

提取篩選得到的重組載體，酶切驗證后由擎科公司測序，拼接后分析插入片段中的完整開放閱讀框(ORF)。對ORF進行Blast比對，確定所得閱讀框的同源基因。通過SWISS-MODEL和Predictprotein分析預(yù)測氨基酸序列信息和二級結(jié)構(gòu)并構(gòu)建三級結(jié)構(gòu)模型。

1.5 降解3-PBA關(guān)鍵酶基因克隆與原核表達

根據(jù)921 bp的ORF序列設(shè)計引物，引物5′端引入NdeⅠ酶切位點，3′端引入HindⅢ酶切位點，引物序列：D34-F：5′-CCCAAGCTTGGGATGAACCGTCAACAAATTGATGCGC-3′，D34-R：5′-GGGAATTCCATATGGAATTCCCTTAAGCACTAGC-GCGACGGCGTTCA-3′，PCR擴增體系：4-D基因組1 μL，PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，D34-F 0.5 μL，D34-R 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 19.5 μL；PCR擴增程序為：94℃，5 min；94℃ 1 min，58℃ 45 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃，10 min?？寺〉玫侥康幕駾34片段；回收PCR產(chǎn)物，連接T載體轉(zhuǎn)化后篩選陽性重組子；雙酶切回收目的基因片段，與表達載體pET-21b連接轉(zhuǎn)化；菌體PCR篩選得到陽性克隆pET-21b-D34，進行菌體PCR和雙酶切驗證；IPTG誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE電泳檢測表達產(chǎn)物，并驗證重組表達載體降解率[7]以及3-PBA降解酶與芳香族底物的反應(yīng)特性[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組文庫構(gòu)建與重組子篩選

構(gòu)建基因組文庫提取基因組時，應(yīng)保證基因組DNA長度在50 kb以上。連接體系中的外源片段與載體的摩爾濃度比例是影響連接效率的關(guān)鍵，本實驗最佳摩爾濃度比為3∶1。通過酶切梯度實驗確定，為得到2～7 kb目的區(qū)域的彌散，1 μg基因組DNA的最佳限制性內(nèi)切酶用量為0.5 U，酶切時間為30 min。如圖1所示,2、3泳道為經(jīng)BamHⅠ完全酶切的線性載體片段，泳道4為基因組部分酶切后的DNA彌散，回收2～7 kb區(qū)域的DNA片段作為目的片段與載體連接。

由于降解3-PBA的關(guān)鍵酶基因為誘導(dǎo)基因，且4-D菌在無機鹽平板生長菌落較小，基因組文庫中功能基因的篩選沒有較好的指示條件，實驗通過混合池途徑篩選已構(gòu)建好的基因組文庫。以3-PBA為底物誘導(dǎo)，逐漸增加3-PBA濃度，成功得到4-D菌基因組文庫中降解3-PBA的重組子4-D-3-4單克隆，酶切后的線性重組質(zhì)粒大小約為4300 bp，插入片段1 600 bp左右。經(jīng)測序拼接后得到1 636 bp的片段，ORF分析得到921 bp的完整開放閱讀框，提交NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對,其與鮑曼不動桿菌鄰苯二酚1，2-雙加氧酶相似性為99%。暫時命名該核酸序列為D34，Genbank登錄號為KR024742。

圖1 基因組部分酶切與線性載體電泳圖Fig.1 Gel extraction of genomic DNA fragment and plasmid pUC19 digested by restriction enzyme.

2.2 氨基酸結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測

氨基酸序列長度為306 aa，預(yù)測分子量為33 438，Aligned Protein數(shù)量為47，PDB結(jié)合結(jié)構(gòu)數(shù)量為13。二級結(jié)構(gòu)主要含42%的α-螺旋，32%的無規(guī)則卷曲，18%的延伸片層和8%的β-轉(zhuǎn)角。運用SWISS-MODEL進行同源建模，D34與不動桿菌2xsr.1.A相似性為92%。SMART分析結(jié)果顯示D34含有兩個結(jié)構(gòu)域，鄰苯二酚(氯代鄰苯二酚，偏苯三酚)1，2-雙加氧酶N端結(jié)構(gòu)域包括23～97位共75個氨基酸殘基，參與氧化反應(yīng)通路和含鄰苯二酚化合物的代謝，具有Fe離子結(jié)合位點。雙加氧酶C端結(jié)構(gòu)域包含101～290位共190個殘基，參與氧化反應(yīng)與細胞內(nèi)芳香族化合物代謝，具有Fe離子結(jié)合能力和催化活性。SEG程序檢測到低復(fù)雜度氨基酸殘基為61～76位(圖2,彩圖見封三圖版)。

2.3 D34原核表達

通過設(shè)計引物(5′端引入NdeⅠ酶切位點，3′端引入HindⅢ酶切位點)成功從4-D菌中克隆得到目的基因D34的完整開放閱讀框，經(jīng)系列酶切連接、雙酶切和PCR驗證后成功構(gòu)建得到重組表達載體pET-21b-D34。SDS-PAGE電泳檢測誘導(dǎo)后的pET-21b-D34表達情況，如圖3所示，可見46 kDa左右的產(chǎn)物經(jīng)誘導(dǎo)后特異性表達。目的條帶分子量比預(yù)測重組蛋白分子量要大，可能是由于pET-21b自身蛋白共表達，或者是閱讀框通讀造成誘導(dǎo)表達產(chǎn)物分子量較大，這也是抑制降解酶活性的因素?？稍谠O(shè)計特異引物時，在終止密碼后加上終止信號，保證完整閱讀框的正確表達。芳香族底物反應(yīng)實驗結(jié)束后，利用分光光度計測定誘導(dǎo)表達產(chǎn)物與鄰苯二酚、對苯二酚和間苯二酚的顏色反應(yīng)，結(jié)果顯示pET-21b-D34誘導(dǎo)后表達產(chǎn)物與鄰苯二酚有明顯的橙黃色反應(yīng)，與對苯二酚和間苯二酚無明顯顏色變化，進一步說明該降解酶的特性，與鄰苯二酚雙加氧酶相符。

圖2 D34編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.2 Predictive tertiary structure diagram of D34 encoded protein.(彩圖見封三圖版)

圖3 表達載體SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of pET-21b-D34.

如圖4所示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后構(gòu)建的重組表達載體pET-21b-D34對3-PBA的降解率為18.7%，而未導(dǎo)入降解基因的對照組不能利用3-PBA作為碳源生長，由于重組菌在3-PBA作唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長緩慢，且誘導(dǎo)表達后蛋白活性不高等原因?qū)е卤磉_載體對3-PBA的降解率較低[9,10]。經(jīng)7 d培養(yǎng)后重組菌OD600僅為0.4左右，可能是由于3-PBA在培養(yǎng)基中溶解度低且次級代謝產(chǎn)物的抑制導(dǎo)致菌體生長緩慢，這也是重組菌對3-PBA利用率較低的原因之一。

圖4 pET-21b-D34和對照組對3-PBA的降解情況Fig.4 The degradation rate of 3-PBA by pET-21b-D34 and control.

3 討論

3.1 3-PBA降解基因的克隆

在基因組DNA提取與保存過程中要避免剪切力等外來機械力作用，切忌反復(fù)凍融。對基因組DNA進行部分酶切時要嚴格確定酶切條件，酶切后的基因組片段過大過小都會影響文庫的代表性。構(gòu)建質(zhì)粒文庫要求大腸桿菌感受態(tài)細胞有較高的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化步驟需要設(shè)置陰性和陽性對照。在基因組DNA文庫的擴增中，由于部分單克隆生長較快，隨著培養(yǎng)時間延長會導(dǎo)致部分克隆丟失，應(yīng)嚴格控制文庫培養(yǎng)時間。在轉(zhuǎn)化涂板的過程中，為了減少假陽性或者衛(wèi)星菌落的過早產(chǎn)生，可在篩選平板上根據(jù)所涂菌液的體積加上氨芐青霉素，能夠極大提高重組率。

對基因組文庫進行功能基因等的篩選，可將沖洗下來的重組菌培養(yǎng)2～3代后搖勻以混合池的形式短期保存，以池為單位進行逐級篩選，可應(yīng)用于抗性基因篩選、降解底物篩選、分子雜交篩選等，極大地減少了工作量。比如脂肪酶可水解三丁酸甘油酯，可在篩選平板上添加乳化的三丁酸甘油酯作為篩選底物，將每個混合池的菌分別涂布到篩選平板上，根據(jù)降解底物產(chǎn)生的透明圈即可得到功能基因克隆。3-PBA降解酶特性未知，因此文庫篩選過程沒有較好的指示條件，且3-PBA在水中溶解度極小，微生物難以利用，在篩選平板上極難生長。本實驗通過混合池途徑馴化篩選，以3-PBA為底物誘導(dǎo)，逐漸增加3-PBA濃度，成功得到4-D菌基因組文庫中降解3-PBA的重組子4-D-3-4單克隆。

3.2 降解酶基因的原核表達

利用大腸桿菌的原核表達體系具有生長周期短、傳代穩(wěn)定的特點，而且目前關(guān)于大腸桿菌遺傳表達的研究較為徹底，利用其對真核生物及原核生物功能基因的表達較為快捷，有較為成熟的構(gòu)建表達體系的流程，尤其是對于構(gòu)建原核生物基因的表達體系，大腸桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)勢明顯，較為廣泛的用于實驗檢測乃至商業(yè)化生產(chǎn)[10]。然而，大腸桿菌表達系統(tǒng)也有其局限性，很多真核基因編碼的蛋白，在合成氨基酸序列后仍需要翻譯后加工、修飾形成三、四級結(jié)構(gòu)的功能蛋白才能顯示活性，而大腸桿菌表達形成的真核蛋白往往以無活性的包涵體結(jié)構(gòu)形式存在，因此為解決大腸桿菌表達系統(tǒng)的這些問題，對表達載體的構(gòu)建優(yōu)化、大腸桿菌的改造以及表達體系優(yōu)化等方面的研究有效解決了大腸桿菌原核表達體系的局限性[11,12]。本實驗通過設(shè)計引物(5′端引入NdeⅠ酶切位點，3′端引入HindⅢ酶切位點)成功從4-D菌中克隆得到了目的基因D34的完整開放閱讀框，經(jīng)系列酶切連接和雙酶切、PCR驗證后成功構(gòu)建得到重組表達載體pET-21b-D34。芳香族底物實驗顯示降解酶具有鄰苯二酚特征顏色反應(yīng)，降解實驗由于菌體生長較緩慢導(dǎo)致降解率較低，仍需優(yōu)化培養(yǎng)條件使降解效率提高。

在實際的污染環(huán)境中，農(nóng)藥殘留多為各種不同類型農(nóng)藥的混合物。為了提高基因工程菌的廣譜性，可通過構(gòu)建共表達載體，將降解多種農(nóng)藥及中間產(chǎn)物的基因進行共表達，從而可同時降解多農(nóng)藥殘留。另外，天然降解菌株所產(chǎn)生的降解酶降解性能往往有很大的提升空間。因此，可利用分子生物學的技術(shù)手段對降解酶基因進行人為的分子改造，利用定點突變、隨機突變等技術(shù)構(gòu)建突變體庫，并通過篩選獲得降解性能更佳的突變體基因。

[1] Mohana K R M, Abhishek C, Rajeev J. Molecularly imprinted polymer coupled with dispersive liquid-liquid micro extraction and injector port silylation: A novel approach for the determination of 3-phenoxybenzoic acid in complex biological samples using gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J. Chromatogr. B, 2014,945-946:23-30.

[2] Edward T, Aklltar M H. Identifieation and charaeterization of aPseudomonasstrain capable of metabolizing Phenoxybenzoates[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57(5):1294-1300.

[3] Miyalnoto J, Beynon K, Roberts T,etal.. The chemistry,metabolism and residue analysis of synthetie pyretllroids[J]. Pure Appl. Chem.,1981,53:1967-2022.

[4] Maloney S, Maule A, Smith A. Mierobial transfonnation of the Pyrethroid inseetieides: Permethrin, deltamethrin, fastae, fenvaerate and fluvalinate[J]. Appl. Environ. Microbiol.,1988,54:2874.

[5] Li S P. Environmental Biology[M].Beijing:China Agricultural Press,2002.

[6] 張艷輝，許 雷. 微生物降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的研究[J]. 生命的化學，2006，11(S)：24-27.

[7] Xie W J, Zhou J M, Wang H Y,etal.. Determination of 3-phenoxybenzoic acid in soil using HPLC[J]. J. Agro-Environ. Sci.,2007,26(2):608-611.

[8] Duan X Q, Zhen J W, Zhang J,etal.. Characteristics of a 3-phenoxybenzoic acid degrading-dacterium and the construction of a engineering bacterium[J]. Environ. Sci.,2011, 32(1):240-242.

[9] Xia W, Yao K, Jia D Y,etal.. Optimization of production condition s for 3-phenoxybenzoic acid degrading enzyme[J]. Food Ind. Tech.,2009, 30(10):181-183.

[10] Xu Y X, Li X H, Qin H,etal.. Isolation and characteristics of a 3-phenoxybenzoic acid degrading-bacterium[J]. Microbiol. Bull.,2005, 32(5):62-67.

[11] Rong J J. Reasearch onE.coliexpression system[J]. Pharm. Biotechnol., 2005, 12(6):416-420.

[12] Xie L, Sun J B, Zhang S Q,etal.. Research progress in theE.coliexpression system [J]. J. South Chin. Univ. Trop. Agric.,2004,10(2):16-19.

[13] 許崇利，楊 梅，許崇波.大腸桿菌表達系統(tǒng)的影響因素[J]. 中國動物檢疫，2010，27(8):66-67.

Cloning and Expression of 3-Phenoxybenzoic Acid Biodegrading Gene fromAcinetobactersp.

LIANG Jun-shi, XU Lei*

GraduateSchoolofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

3-Phenoxybenzoic acid (3-PBA) is known as non-specific intermediate products of pyrethriods pesticide, which has antiestrogenic activity, and can disturb the endocrine systeminvivo. 3-PBA has wider migration, longer half-life period, and higher biotoxicity than the pyrethroid pesticide, so it has been used as a marker for pyrethroids exposure. With the contruction and screening of 4-D(Acinetobactersp.) genomic library, the key gene having a ORF of 921 bp and encoding an amino acid of 306 aa for degrading 3-PBA was screened, its GenBank accession number was KR024742. Homolog comparison results and substrate experiments inferred that it was catechol dioxygenase. The primer was designed on the authority of opening reading frames(ORF) and added with restriction sites ofNdeⅠ andHindⅢ. With genomic DNA of 4-D as template, the D34 gene was cloned. The recombinant expression vector pET-21b-D34 plasmid was constructed and transformed into competent cell BL21 (DE3). After inducing by IPTG(0.1 mmol/L), the degration rate of 3-PBA was 18.7%. Results provided theory reference for microbial environmental restoration of 3-PBA population.

Acinetobactersp.; genomic library; 3-phenoxybenzoic acid; prokaryotic expression

2015-05-26; 接受日期：2015-06-19

國家863計劃項目(2011AA10A205)資助。

梁俊仕，碩士研究生，主要從事微生物分子生物學與基因工程研究。E-mail：liangjunshi1027@126.com。*通信作者：許雷，研究員，主要從事生物化學與分子生物學研究。E-mail：xulei@caas.net.cn。

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.04.09