張 艷，劉宴村，宋有濤，2＊

（1.遼寧省動物資源與疫病防治重點實驗室／遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧沈陽110036；2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110036）

朊病毒［PSI＋］是一種只有蛋白質(zhì)而沒有核酸的傳染因子 ，能在多物種間傳播，其所致疾病為慢性、致死性、神經(jīng)退行性傳染病，致死率高達(dá)100%，主要包括瘋牛病、綿羊瘙癢癥和人克雅氏病等［1］。它具有兩種不同的分子構(gòu)象：一種是存在于正常機體中，沒有致病作用，稱為細(xì)胞朊蛋白（PrPC）；另一種是僅存在于感染動物的細(xì)胞中，稱為朊病毒蛋白（PrPSc）。PrPSc是由PrPC發(fā)生錯誤折疊后形成的富含β折疊和具有抗蛋白酶水解特性的異常朊蛋白，兩者具有相同的一級結(jié)構(gòu)，且由同一個基因Prnp編碼，但二極結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)則有著顯著差異［2］。由于朊病毒的分子致病機制的復(fù)雜性，目前對朊病毒類疾病的治療仍然缺乏有效的治療方法［3］。

酵母中存在著和哺乳動物類似的朊病毒，具有與哺乳動物的類淀粉狀纖維形成的分子伴侶體系和生物化學(xué)環(huán)境相似的特性［4］，Blondel M博士利用酵母細(xì)胞篩選方法篩選出了兩種有效的抗酵母朊病毒的化合物，其中一種能有效對抗哺乳動物的朊病毒［5］。Bach S等［6］利用酵母朊病毒模型從一些天然藥物中篩選出具有抗朊病毒的活性成分。研究表明，姜黃素、阿魏酸能抑制朊病毒的復(fù)制，兩面針提取物可使酵母朊病毒聚集狀態(tài)（白色）轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇軤顟B(tài)（紅色）。從丹參中分離出的丹酚酸B，有抑制Aβ聚集作用且對神經(jīng)具有保護作用，對與朊病毒致病機理相似的阿爾茨海默癥具有潛在治療作用［7-9］。本試驗基于抗酵母朊病毒［PSI＋］藥物篩選模型，以鉤藤為研究對象，利用細(xì)胞表型試驗和半變性瓊脂糖凝膠電泳（semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis，SDD-AGE）結(jié)合蛋白印跡法［10-11］研究鉤藤對朊病毒的影響，為今后深入研究中藥成分治療朊病毒疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）：MATαkar1SUQ5ade2-1his3Δ202leu2Δ1 trp1Δ63ura3-52erg6：：KanMX，［PSI＋］由美國NIH的Masison D博士提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 1／2YPD培養(yǎng)基：20g／L蛋白胨，5 g／L酵母浸出粉，20g／L葡萄糖，固體培養(yǎng)基需加20g／L瓊脂粉，在115℃高壓蒸汽滅菌25min。YPAD固體培養(yǎng)基：20g／L蛋白胨，00g／L酵母浸出粉，0.4g／L腺嘌呤，20g／L瓊脂粉，20g／L葡萄糖，在115℃高壓蒸汽滅菌25min。SD-Ade固體培養(yǎng)基：7g／L YNB-AA、20g／L瓊脂粉、20g／L葡萄糖，在115℃高壓蒸汽滅菌25min。倒平板前加入氨基酸：Ura 20mg／L，Trp 20mg／L，His 20mg／L，Leu 60mg／L。

1.1.3 主要藥品與試劑 鉤藤，購自遼寧省沈陽市國大藥房產(chǎn)品；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、瓊脂粉，北京索萊寶生物科技有限公司；腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸，北京市鼎國技術(shù)有限公司產(chǎn)品；羊抗sup35抗體與HRP標(biāo)記的驢抗羊IgG，圣克魯斯生物技術(shù)公司（美國）產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 鉤藤水提取物的制備及酵母朊病毒［PSI＋］遺傳表型分析 將鉤藤莖粉碎，用蒸餾水在95℃條件下浸提提取3h，過濾離心，抽濾收集濾液，用濾液配制1／2YPD液體培養(yǎng)基，滅菌后備用。隨機挑取3個～4個［PSI＋］酵母單菌落于10mL液體培養(yǎng)基中，在恒溫水浴24℃震蕩過夜活化后，檢測菌液OD 600nm為0.2左右時，按100mL／L接種量接種到含有鉤藤水提取物的1／2YPD液體培養(yǎng)基中，24℃震蕩培養(yǎng)5d，每天及時更換新鮮培養(yǎng)液（含有鉤藤水提物），5d后稀釋培養(yǎng)液并涂布于1／2YPD固體平板，平板于24℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d～7d，觀察菌落顏色變化并記錄［12］。

1.2.2 鉤藤醇提取物的制備及酵母朊病毒［PSI＋］遺傳表型分析 將鉤藤莖粉碎，稱取10g加入100 mL的750mL／L乙醇在95℃水浴中回流提取2h，重復(fù)3次，合并提取液，56℃減壓蒸發(fā)濃縮，然后60℃烘干至恒重，用5%DMSO（二甲基亞楓）溶解使提取液濃度為200g／L［13-14］。隨機挑取［PSI＋］酵母細(xì)胞在24℃過夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液OD 600nm為0.2左右，按100mL／L接種量分別接種到含有不同濃度鉤藤醇提取物的1／2YPD液體培養(yǎng)基中，在24℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每天更換新的液體培養(yǎng)基和鉤藤醇提取物；分別在1、3、5d取藥物混合培養(yǎng)液稀釋后涂布于1／2YPD固體平板，將平板置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d～7d后，觀察是否出現(xiàn)紅色菌落并記錄［14］。

1.2.3 影印培養(yǎng)法檢測鉤藤醇提物對酵母朊病毒細(xì)胞的治療作用 為了排除鉤藤醇提物治療感染朊病毒酵母細(xì)胞的假陽性可能，本試驗利用影印培養(yǎng)法隨機挑取鉤藤醇提取物治療的紅色菌落劃線于1／2YPD平板上于30℃培養(yǎng)1d后，分別影印到SD-Ade、1／2YPD和YPAD固體培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)5d，記錄菌落生長情況。

1.2.4 SDD-AGE／Western blot在蛋白水平檢測鉤藤醇提取對酵母朊病毒細(xì)胞的治療作用 隨機挑取3個～4個白色菌株和被鉤藤醇提取治療的紅色菌株，分別接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩培養(yǎng)約14h～16h進行活化，按20mL／L的接種量進行擴大培養(yǎng)，檢測菌液OD 600nm為1.5左右時停止培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，加入裂解緩沖液，用珠磨儀進行細(xì)胞破碎，離心收集上清得到蛋白樣品；進行15g／L的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在0℃、恒流0.35A條件下轉(zhuǎn)膜1h，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，加入羊抗Sup35抗體（一抗）孵育1h，4℃冰箱過夜后洗膜，加入HRP標(biāo)記的驢抗羊IgG（二抗）孵育1h后，洗膜，采用ECL發(fā)光試劑盒對其進行放射自顯影檢測，保存圖像信息。

2 結(jié)果

2.1 鉤藤水提取物和醇提取物對酵母朊病毒［PSI＋］的作用效果

鉤藤水提取物作用于感染朊病毒［PSI＋］的酵母細(xì)胞5d后，涂板24℃恒溫培養(yǎng)7d后，可以觀察到?jīng)]有紅色菌落出現(xiàn)（圖1），說明鉤藤水提物對朊病毒［PSI＋］酵母細(xì)胞沒有治療效果。鉤藤醇提物作用于感染朊病毒［PSI＋］的酵母細(xì)胞5d后，有紅色菌落出現(xiàn)（圖2），說明鉤藤醇提取物對朊病毒［PSI＋］酵母細(xì)胞有一定的治療作用。

圖1 鉤藤水提取物對酵母朊病毒［PSI＋］模型的治療效果Fig.1 Effect of aqueous extract from uncaria on yeast prion［PSI＋ ］

2.2 影印培養(yǎng)法檢測鉤藤醇提取物對酵母朊病毒［PSI＋］模型的治療效果

將鉤藤醇提取物治療的酵母紅色細(xì)胞影印在1／2YPD培養(yǎng)基上顯示為紅色菌落，在YPAD培養(yǎng)基上顯示為白色菌落，而在SD-Ade的培養(yǎng)基上不生長（圖3），因為治愈的［PSI-］細(xì)胞不能合成腺嘌呤。因此，在表型水平上進一步驗證鉤藤醇提取物對酵母朊病毒有一定的治療作用。

2.3 蛋白水平分析鉤藤醇提取對酵母病毒［PSI＋］的作用效果

為了更全面分析鉤藤醇提取物對酵母病毒［PSI＋］的作用效果，彌補表型分析所帶來的假陽性和假陰性的干擾，我們采用SDD-AGE／Western blot技術(shù)，比較不同菌株中Sup35p蛋白的聚集狀態(tài)。傳統(tǒng)的SDS-PAGE只能定性檢測朊病毒能否發(fā)生聚集，不能定量分析聚合體的大小和聚集狀態(tài)。而聚合體的大小正是在研究朊病毒的傳播及繁殖的一個十分重要的性質(zhì)。

如圖4所示，在［PSI＋］細(xì)胞朊病毒Sup35p蛋白主要以聚集體形式存在，而在［PSI-］細(xì)胞中，Sup35p主要以單體形式存在。鉤藤醇提物作用酵母朊病毒［PSI＋］細(xì)胞5d后的紅色菌落，細(xì)胞內(nèi)Sup35p蛋白出現(xiàn)了單體和少量聚集體，其聚集體遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于［PSI＋］，經(jīng)過3次重復(fù)試驗，說明鉤藤醇提取物對酵母朊病毒［PSI＋］模型有一定的治療效果。

圖2 鉤藤醇提物對酵母朊病毒［PSI＋］模型的治療效果Fig.2 Curative effect of alcohol extracts of uncaria on yeast［PSI＋ ］prion

圖3 利用影印培養(yǎng)法檢測鉤藤醇提物的治療效果Fig.3 The curing effects of alcohol extracts of uncaria on yeast［PSI＋］prion detectionby replica plating

圖4 SDD-AGE／westren blot分析鉤藤醇提取物對酵母阮病毒［PSI＋］的影響Fig.4 Effects of alcohol extracts of uncaria analyzed on yeast［PSI＋］prion by SDD-AGE／Western blot

3 討論

鉤藤是我國傳統(tǒng)中藥，為茜草科鉤藤屬植物，其帶鉤莖枝入藥，性涼味苦甘，具有清熱平肝、熄風(fēng)定驚的作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，鉤藤具有顯著的降壓、抗心律失常、鎮(zhèn)靜和治療老年癡呆癥等功效［15］。鉤藤有效成分為吲哚類生物堿，主要包括鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿和異去氫鉤藤堿等，其中鉤藤堿含量最高，為主要有效成分。有文獻表明石杉堿甲是從草藥千層塔中分離得到的一種石松類生物堿，作為乙酰膽堿酯酶抑制劑治療阿爾茨海默病、血管性癡呆、良性記憶障礙等已有超過16年的臨床應(yīng)用經(jīng)驗［16］。據(jù)報道，鉤藤堿具有顯著的抑制Aβ纖維生成的作用，以抑制Aβ的生成是治療阿茲海默癥的有效策略［17］。阿爾茨海默癥和帕金森病等與朊病毒疾病發(fā)病機理相似的疾病，所以推測鉤藤中的生物堿有抗酵母阮病毒的作用，本實驗室使用抗酵母朊病毒藥物篩選平臺，在細(xì)胞表型和蛋白水平分析了鉤藤醇提取物抗朊病毒作用。在［PSI＋］細(xì)胞中，大多數(shù)的Sup35p聚集成纖維狀，導(dǎo)致無義突變抑制，產(chǎn)生終止密碼子通讀現(xiàn)象，合成腺嘌呤，能在缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長為白色菌落；在［PSI-］細(xì)胞中，Sup35p呈可溶的單體，需要在含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長，如果菌株在酵母浸粉／葡萄糖／蛋白胨的培養(yǎng)基，細(xì)胞由于生物合成途徑被阻斷導(dǎo)致紅色中間產(chǎn)物積累而形成紅色菌落，這個表型系統(tǒng)可通過顏色辨別［PSI＋］的方法，初步分析藥物對［PSI＋］表型的治療效果［18］。研究結(jié)果表明，鉤藤水提取物處理的酵母朊病毒［PSI＋］模型在表型上為白色菌落，蛋白水平上為聚集體狀態(tài)，表明無治療效果，而鉤藤醇提物處理的酵母朊病毒［PSI＋］模型為紅色菌落，在蛋白水平上顯示一定的治療作用，由此可知，鉤藤中含有抗酵母朊病毒的成分，而且它存在于醇提取物中。這將對抗朊病毒有效藥物的開發(fā)具有重要意義。

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