童宏龍劉英波李江黃文榮譚懷美

1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002;2.遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，貴州遵義563000;3.貴州百花醫(yī)藥股份有限公司，貴州遵義563000

HPLC測(cè)定鉤藤藥材中鉤藤堿、異鉤藤堿的含量

童宏龍1劉英波2李江1黃文榮3譚懷美2

1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002;2.遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，貴州遵義563000;3.貴州百花醫(yī)藥股份有限公司，貴州遵義563000

目的:用HPLC法建立鉤藤藥材中鉤藤堿(Rhynchophylline)、異鉤藤堿(Isorhynchophylline)的含量測(cè)定方法，用于鉤藤藥材的質(zhì)量控制。方法:色譜柱為Diamonsil C18柱(4．6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇:水=65:35(V/V，含0.01mmol/L三乙胺，冰醋酸調(diào)PH7.0)為流動(dòng)相，流速為1.0 ml·min－1，在245nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，測(cè)定鉤藤藥材中鉤藤堿、異鉤藤堿含量。結(jié)果:鉤藤堿及異鉤藤堿的回歸方程分別為Y=1.0E+6x－21142和Y=1.1E+6x－13566，線(xiàn)性范圍分別為0.254～1.524 μg和0.216～1.296 μg，相關(guān)系數(shù)分別0.9999和0.9999。結(jié)論:本法正確、簡(jiǎn)便、快速，對(duì)于控制和評(píng)價(jià)鉤藤藥材的品質(zhì)有重要意義。

鉤藤;高效液相色譜法;鉤藤堿;異鉤藤堿

鉤藤為茜草科植物鉤藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.Ex Havil、大葉鉤藤Uncaria macrophylla Wall.、毛鉤藤Uncaria hirsuia Havil.、華鉤藤Uncaria sinensis(Oliv.)Havil或無(wú)柄果鉤藤Uncaria sessilifrucius Roxb.的干燥帶鉤莖枝。鉤藤具有息風(fēng)定驚，清熱平肝的作用，用于肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，驚癇抽搐，感冒夾驚，小兒驚啼，妊娠子癇，頭痛眩暈［1］。鉤藤的莖枝中含有多種吲哚類(lèi)生物堿，主要有效成分為鉤藤堿和異鉤藤堿，此外還含有金絲桃苷、兒茶素等酚性成分［2］。宋純清等［3］研究表明降壓作用異鉤藤堿(42.0%)＞鉤藤堿(32.1%)＞鉤藤總堿(21.3%)＞鉤藤非生物堿(12.4%)。

我國(guó)對(duì)鉤藤藥材的研究已經(jīng)有好幾十年的歷史了。雖然鉤藤相關(guān)的文獻(xiàn)有很多，包括鉤藤中化學(xué)成分的研究、生物堿的研究、藥理的研究、毒理的研究等等，高效液相色譜法測(cè)定鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿的含量也有一定研究，但是相關(guān)文獻(xiàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果較難重復(fù)，可能跟藥材的多樣性有關(guān)?！吨袊?guó)藥典》2010版關(guān)于鉤藤的部分也沒(méi)有收錄HPLC法測(cè)定鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿含量等相關(guān)內(nèi)容。本文以鉤藤堿、異鉤藤堿為指標(biāo)，利用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定，建立相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為后續(xù)研究提供相關(guān)信息。

1 儀器與試藥

島津LC－20AT高效液相色譜儀、DAD紫外檢測(cè)器、威瑪龍色譜工作站、AE/240型電子天平(上海梅特勒儀器有限公司)、AVY 220型電子天平(日本島津)、SK 8210 HP型超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)儀器有限公司)。

鉤藤堿對(duì)照品(南昌貝塔生物科技有限公司，批號(hào):10525－200912，供含量測(cè)定用，含量≥98%)、異鉤藤堿對(duì)照品(南昌貝塔生物科技有限公司，批號(hào):10172－200912，供含量測(cè)定用，含量≥98%)、鉤藤藥材(采自貴州省開(kāi)陽(yáng)縣鉤藤種植基地，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥教研室劉芃老師鑒定為茜草科植物鉤藤Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.Ex Havil。乙醇(食用酒精，95%)、三乙胺(重慶金山化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):080708)為分析純，甲醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)，批號(hào):20090520)為色譜純，水為娃哈哈純凈水(貴陽(yáng)哇哈哈昌盛飲料有限公司，批號(hào)13156Y)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱:Diamonsil－Cl8(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇:水=65:35(V/V，含0.01mmol/L三乙胺，冰醋酸調(diào)PH7.0);檢測(cè)波長(zhǎng):245nm;柱溫:30℃;流速:1 mL?min－1;進(jìn)樣量:10 μL;靈敏度:1.0 AU。

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取對(duì)照品鉤藤堿1.27 mg、異鉤藤堿1.08mg加80%甲醇溶解，定容至10 mL量瓶，即得鉤藤堿、異鉤藤堿混合對(duì)照品供試液，其中鉤藤堿為0.127mg/ml、異鉤藤堿為0.108mg/ml。

2.3 供試品溶液的制備將樣品粉碎，過(guò)一號(hào)篩。精密稱(chēng)取9.9934 g，置250ml錐形瓶中，加入100ml 80%的乙醇液，混勻，浸泡1h，超聲處理20 min，過(guò)濾，連續(xù)2次。合并提取液，水浴(50℃)蒸干，用80%甲醇定容至10 mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察精密吸取混合對(duì)照品溶液2，4，8，10，12，16 μL。分別以鉤藤堿、異鉤藤堿進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得鉤藤堿回歸方程為:Y=1.0E+6x－21142(r=0.9999)，結(jié)果表明鉤藤堿在0.254～1.524μg有良好的線(xiàn)性關(guān)系;異鉤藤堿回歸方程為:Y=1.1E+6x－13566，(r=0.9999)，結(jié)果表明異鉤藤堿在0.216～1.296μg有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別記錄鉤藤堿、異鉤藤堿峰面積值，RSD值分別為2.97%和2.69%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取樣品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h，進(jìn)樣，分別測(cè)定鉤藤堿、異鉤藤堿峰面積值。RSD值分別為1.56%和1.27%，說(shuō)明指標(biāo)成分在24h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次鉤藤6份，分別用2.3項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，并按上述色譜條件操作，分別測(cè)得樣品中鉤藤堿、異鉤藤堿含量，RSD值分別為1.07%和1.17%，說(shuō)明測(cè)量方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)取同一批次鉤藤6份，分別置燒瓶中，分別精密加入濃度為0.1990 mg·mL－1的鉤藤堿對(duì)照液1mL和濃度為2.2335mg·mL－1的異鉤藤堿對(duì)照液1mL，分別用1.4項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，測(cè)得樣品中鉤藤堿、異鉤藤堿的含量。鉤藤堿、異鉤藤堿平均回收率分別為99.69%、102.22;RSD值分別為1.51%和1.09%，說(shuō)明所建立的方法加樣回收率較高，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表2 異鉤藤堿加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品中鉤藤堿、異鉤藤堿含量測(cè)定分別稱(chēng)取7份鉤藤樣品按2.3項(xiàng)下制備，精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各10μL，照上述方法測(cè)定，本次實(shí)驗(yàn)中所用鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿含量分別為0.01910mg·g－1、0.2320mg·g－1，見(jiàn)圖1。

圖1 鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿HPLC

3 討論

3.1 色譜條件的選擇張榮等［4］研究表明以甲醇∶水=70∶30(V/V，含0.01mmol/L三乙胺，冰醋酸調(diào)PH7.0)為流動(dòng)相時(shí)，鉤藤堿與異鉤藤堿能達(dá)到良好分離且峰形較好。在本研究所用鉤藤藥材測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于鉤藤堿、異鉤藤堿中間有一物質(zhì)峰，原流動(dòng)相不能使三者較好分離，故將流動(dòng)相調(diào)整為甲醇∶水=65∶35(V/V，含0.01mmol/L三乙胺，冰醋酸調(diào)PH7.0)。

3.2 提取方法和溶劑的選擇文獻(xiàn)表明［5］鉤藤在煎煮過(guò)程中成分會(huì)發(fā)生變化。鉤藤堿、異鉤藤堿均熱不穩(wěn)定，所以采用超聲連續(xù)提取。選用不同濃度乙醇作為提取溶劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明80%乙醇提取率較高，故本文選擇80%乙醇作為提取溶劑。

3.3 預(yù)實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)相關(guān)問(wèn)題本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，配置的鉤藤堿對(duì)照品溶液一周后重新測(cè)定，對(duì)比原測(cè)定圖譜發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿基本穩(wěn)定，但在異鉤藤堿岀峰處多出一峰，含量較小，懷疑鉤藤堿少許轉(zhuǎn)化為異鉤藤堿，這與原田正敏［6］研究結(jié)果一致。但異鉤藤堿測(cè)定后對(duì)比原測(cè)定圖譜發(fā)現(xiàn)，異鉤藤堿在甲醇中不穩(wěn)定。在異鉤藤堿峰后面出現(xiàn)一個(gè)與異鉤藤堿含量相當(dāng)?shù)姆?，依?jù)相關(guān)文獻(xiàn)［7］中鉤藤總生物堿分離順序估計(jì)為異去氫鉤藤堿。但是鉤藤堿、異鉤藤堿在甲醇中24小時(shí)內(nèi)含量較穩(wěn)定，故以鉤藤堿、異鉤藤堿含量來(lái)評(píng)價(jià)鉤藤藥材質(zhì)量是可行的。

綜上所述，本研究方法正確、簡(jiǎn)便、快速，對(duì)于控制和評(píng)價(jià)鉤藤藥材的品質(zhì)有重要意義。

［1］中國(guó)藥典(一部)［S］．2010:240．

［2］姜偉，張麗．鉤藤的藥理作用研究［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，15(21):3013．

［3］宋純清，樊懿，黃偉暉，等．鉤藤中不同成分降壓作用的差異［J］．中草藥，2000，31(10):7621．

［4］張榮，劉睿，劉啟德，等．鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿的提取與含量測(cè)定［J］．中藥新藥與臨床藥理，2009，20(4):338～341．

［5］黃卓謙，劉建利，王玉英，等．鉤藤煎煮過(guò)程中化學(xué)成分變化的研究［J］．西北大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，38(5):787～789．

［6］原田正敏．日本常用中藥的定量分析—防己、鉤藤［J］．國(guó)外醫(yī)藥植物藥分冊(cè)，1991，6(5):219．

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The study of the content determination of Rhynchophylline and Isorhynchophylline in Uncaria Rhynchophylla by HPLC

TONG Hong－long，LI Jiang，HUANG Wen－rong
1.GuiYang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China;2.Guizhou Baihua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Zunyi 563000，China

Objective:To determine the contents of Rhynchophylline and Isorhynchophylline in Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.by the method of HPLC.Methods:Contents of the isoflavones(Rhynchophylline and Isorhynchophylline)in Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.was measured by HPLC［a column of Diamonsil Cl8(4.6 mm×250 mm，5 um)，methanol:water=65:35(V/V，with 0.01mmol/L triethylamine，glacial acetic acid adjusted PH7.0)as the mobile phase，flow rate 1.0 mL·min－1，detective wave 245 nm］to determine the contents of Rhynchophylline and Isorhynchophylline．Results:The two regression equations are Y=1.0E+6x－21142 and Y=1.1E+6x－13566，and have good linearity in the range of 0.254～1.524 ug and 0.216～1.296 ug，r=0.9999 and 0.9999 respectively.Conclusion:The method is correct，simple，rapid，it is vital for controlling and evaluating the quality of Chinese medicine Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.

Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jacks.;HPLC;Rhynchophylline;Isorhynchophylline

R927.2

A

1007－8517(2012)18－0056－02

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)—鉤藤降壓緩釋制劑的研制。

劉英波(1979－)，男，苗族，貴州天柱人，碩士，主要從事中藥—民族藥新制劑與新劑型研究。E－mail:gzliuyb@126．com。

2012.07.29)