房媛媛，馬暉玲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

AsA-GSH循環(huán)參與2，3-丁二醇、2R，3R-丁二醇誘導(dǎo)后匍匐翦股穎的抗病反應(yīng)

房媛媛，馬暉玲*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070）

用250μmol／L的2，3-丁二醇（2，3-BD）與100μmol／L的2R，3R-丁二醇（2R，3R-BD）注射至匍匐翦股穎根部后接種立枯絲核菌，誘導(dǎo)匍匐翦股穎對褐斑病的抗性。測定兩誘導(dǎo)劑處理對立枯絲核菌發(fā)病率的影響，分析誘導(dǎo)后匍匐翦股穎葉片抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)中關(guān)鍵酶活性及氧化還原水平變化情況，確定2，3-BD與2R，3R-BD在誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗病性過程中，抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)的變化及其與抗病性的相關(guān)性。結(jié)果表明，2，3-BD與2R，3R-BD處理匍匐翦股穎后明顯降低接菌后的病葉率，同時(shí)葉片抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性增幅低于對照，谷胱甘肽還原酶（GR）活性提高，還原型抗壞血酸（As A）含量呈前期減少后期增加趨勢，脫氫抗壞血酸（DHA）含量在第1，9天出現(xiàn)兩次高峰，與對照相比顯著提高，且兩處理的As A／DHA在第5天達(dá)到最大值，分別為對照的5．0，3．4倍，還原型谷胱甘肽（GSH）含量顯著提高，并且兩處理的GSH與氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值在第9天達(dá)到最大值，分別為對照的2．34，1．66倍。2，3-BD與2R，3R-BD誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病的過程中，抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)維持較高效率參與植物抗病反應(yīng)。

匍匐翦股穎；2，3-丁二醇；2R，3R-丁二醇；褐斑病

匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）屬禾本科翦股穎屬，是高爾夫球場果嶺、草地網(wǎng)球場、草地保齡球場等精細(xì)草坪的首選草種，也用于庭院、公園等養(yǎng)護(hù)水平較高的綠地，是重要的冷季型草坪草之一。匍匐翦股穎的不定根入土較淺，喜水，易感病，如幣斑?。⊿clerotinia homoeocarpa）、褐斑?。≧hizoctonia solani）、霜霉病（Sclerospora graminicola）、雪腐?。≒ythium iwayamai）、黑粉?。║stilagomaydis）等是其常見病害［1］。草坪病害的傳統(tǒng)防治多采用培育和利用抗病品種及使用化學(xué)殺菌劑［2］。傳統(tǒng)抗病育種方法育種周期長，親本材料獲取有限，其應(yīng)用受到很大限制?；瘜W(xué)殺菌劑對病害的防除效果大多不理想，并且化學(xué)農(nóng)藥的噴施嚴(yán)重污染環(huán)境［3-4］。大量研究證明，植物本身具有抵抗病原菌侵染的潛能［5］。誘導(dǎo)植物抗病性是通過物理、化學(xué)及生物等方式激發(fā)植物對病原微生物的本原抵抗力。利用誘導(dǎo)劑誘發(fā)植物固有抗病性與化學(xué)殺菌劑相比具有抗性穩(wěn)定、持久、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)［6-7］。引起誘導(dǎo)抗病反應(yīng)的系統(tǒng)性機(jī)制至今尚未完全闡明，目前植物抗病性誘導(dǎo)普遍認(rèn)同兩種方式，即系統(tǒng)獲得抗性（SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）。

SAR的信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)在不同植物上已有大量研究，ISR與乙烯（ET）／茉莉酸（JA）信號(hào)途徑相關(guān)［8］，在禾本科中ISR方面的報(bào)道并不多。2003年Suzuki等［9］在匍匐翦股穎的抗病誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌（P.fluorescens）株系HP72可引發(fā)匍匐翦股穎對立枯絲核菌（R.solani）產(chǎn)生抗性。2004年Ryu等［10］研究認(rèn)為，植物根際促生菌分泌的揮發(fā)性有機(jī)物2，3-butanediol及其同分異構(gòu)體在誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的過程中具有重要的作用。2010年，加拿大學(xué)者Cortes-Barco等［11］報(bào)道了BDO（2R，3R-butanediol）和PC1（異鏈烷烴混合物）以ISR方式根部施入植株體后可抑制分別由核盤菌（Sclerotinia homoeocarpa），立枯絲核菌和鐮刀菌（Microdochium nivale）引起的3種草坪葉病，施入PC1或BDO可減少匍匐翦股穎葉病區(qū)域約20%～40%。

研究現(xiàn)表明，ISR的信號(hào)分子一般是ET和JA等。Cortes-Barco等［12］在煙草的研究中發(fā)現(xiàn)丁二醇（BDO）和PC1對煙草炭疽病有顯著的抑制作用，認(rèn)為BDO誘導(dǎo)的抗病性是通過ISR方式產(chǎn)生的。2，3-butanediol作為根際促生菌的可揮發(fā)性分泌物，其不同異構(gòu)體對誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性有不同影響。Han等［13］的研究表明，2，3-butanediol的左旋體2R，3R-BD可以誘導(dǎo)煙草抗馬鈴薯軟腐?。‥rwinia carotovora subsp．carotovora），但不能夠?qū)煵菀盎鸩。≒.syringae pv．tabaci）產(chǎn)生抗性，2，3-butanediol的右旋體2S，3S-BD則對植物體沒有作用。而Ryu等［10］的研究表明2，3-butanediol的外消旋體（2R，3R-BD與2S，3S-BD的混合物）可誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生ISR抗病方式。這表明2，3-butanediol及其同分異構(gòu)體誘導(dǎo)不同植物對多種病原菌產(chǎn)生抗性具有個(gè)體差異性，誘導(dǎo)劑的施用濃度及其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

抗壞血酸（As A）-谷胱甘肽（GSH）不僅有效維持活性氧代謝平衡，預(yù)防氧化傷害，在植物體防御反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用［14］。As A不僅自身可以改變植物體內(nèi)PR蛋白的表達(dá)，提高植物的抗病性，低水平As A或As A氧化還原態(tài)不平衡也會(huì)調(diào)節(jié)MAP激酶（mitogen-activated protein）或直接誘導(dǎo)信號(hào)分子激活或增強(qiáng)抗病基因表達(dá)，從而提高植物抗病性［15-16］。研究表明谷胱甘肽作為信號(hào)分子誘導(dǎo)多種防御基因表達(dá)，介導(dǎo)植物體對病原菌的防御反應(yīng)，如參與SA介導(dǎo)的信號(hào)途徑［17］。抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）等是促進(jìn)并維持As A-GSH循環(huán)的重要酶組分，病原菌侵染時(shí)其酶活性被改變，如殼聚糖誘導(dǎo)臍橙抗霜霉病，果實(shí)中谷胱甘肽還原酶（GR）活性提高，抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性被抑制，延緩還原性抗壞血酸（As A）含量下降的同時(shí)，引起誘導(dǎo)初期還原性谷胱甘肽（GSH）積累［18］。

本研究采用新型抗病誘導(dǎo)劑2，3-丁二醇（2，3-BD立體異構(gòu)體的混合物）、2R，3R-丁二醇（2，3-BD的左旋體），誘導(dǎo)匍匐翦股穎對褐斑病產(chǎn)生抗性，并測定接種病原菌前后匍匐翦股穎As A-GSH循環(huán)多種酶及代謝物質(zhì)含量變化，以期為探清2，3-丁二醇（2，3-BD）、2R，3R-丁二醇（2R，3R-BD）誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗病機(jī)制提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1．1 供試品種、化學(xué)試劑及病原菌

供試匍匐翦股穎品種為Penn-A4，由北京克勞沃公司提供。誘導(dǎo)劑2R，3R-BD購自Sigma，2，3-BD購自西亞試劑。匍匐翦股穎褐斑病病原物為立枯絲核菌，購自中國科學(xué)院菌種保存中心。

1．2 2R，3R-BD與2，3-BD對匍匐翦股穎褐斑病的抗性誘導(dǎo)

試驗(yàn)于2014年4月開始，設(shè)置3個(gè)處理：250μmol／L的2，3-BD（2，3丁二醇立體異構(gòu)體的混合物）、100 μmol／L的2R，3R-BD（2，3-丁二醇的左旋體）、不用誘導(dǎo)劑處理只接種病原菌為CK。240 m L組培瓶裝入滅菌的沙土混合物（土∶沙＝2∶1）70 g。種子用滅菌水浸泡5 h，70%乙醇溶液浸泡1 min，10%次氯酸鈉浸泡15 min，無菌水沖洗6～7次，每瓶0．3 g種子，種植于組培瓶。每個(gè)處理15瓶，重復(fù)3次，（25±2）℃組培室中培養(yǎng)，光周期為16 h／d。

種植后第8天，將10 m L誘導(dǎo)劑注射入匍匐翦股穎幼苗根部，對照用無菌水代替。立枯絲核菌在PDA固體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)4 d后用打孔器取6 mm直徑菌絲塊，加入到PDA液體培養(yǎng)基，在25℃、100 r／min的搖床培養(yǎng)5 d后研磨為菌絲，確定濃度為OD340＝0．8，使用該濃度菌絲懸浮液噴霧法接種誘導(dǎo)劑處理后第7天的匍匐翦股穎。

1．3 病葉率統(tǒng)計(jì)

接種后第7，10，15天，參考任繼周［19］的方法統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。病葉率計(jì)算方法如下：

病葉率（%）＝發(fā)病葉片數(shù)／調(diào)查總數(shù)×100

1．4 抗病指標(biāo)測定

2，3-BD、2R，3R-BD、CK共3個(gè)處理，接種立枯絲核菌后第1，3，5，7，9天分別取樣，測定匍匐翦股穎抗壞血酸過氧化物酶（APX）與谷胱甘肽還原酶（GR）活性，還原型抗壞血酸（As A）、脫氫抗壞血酸（DHA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量及As A／DHA、GSH／GSSG的變化。

1．4．1 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定 參考Nakano和Asada［20］方法測定并修改。酶促反應(yīng)體系依次加入2．6 m L的0．1 mol／L、p H 7．5的磷酸反應(yīng)緩沖液（含0．1 mmol／L EDTA，1 mmol／L壞血酸和2% PVP）和0．1 m L的酶提取液，最后加入0．3 m L H2O2（2 mmol／L）溶液啟動(dòng)酶促反應(yīng)，從啟動(dòng)后15 s開始記錄每30 s反應(yīng)體系在290 nm處的吸光度值，連續(xù)測定3 min。酶活性單位定義為：氧化1μmol／min As A為1單位（U）APX酶活性。

1．4．2 谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定 參考Foyer和Halliwell［21］方法并修改。酶促反應(yīng)體系依次加入2．8 m L的0．1 mol／L、p H 7．5的磷酸緩沖液（含1 mmol／L EDAT），0．1 m L氧化型谷胱甘肽溶液（5 mmol／L）和0．1 m L的酶提取液，最后加40μL NADPH（4 mmol／L）溶液以啟動(dòng)酶促反應(yīng)。從啟動(dòng)后15 s開始記錄每30 s反應(yīng)體系在340 nm的吸光度值，連續(xù)測定3 min。酶活性單位定義為：氧化1μmol／min NADPH為1單位（U）GR酶活性。

1．4．3 還原型抗壞血酸（As A）含量測定 參照Kampfenkel等［22］的方法并修改。測定總As A時(shí)，反應(yīng)體系中含有：200μL提取液，500μL的200 mmol／L PBS（內(nèi)含5 mmol／L EDTA，p H 7．4）和100μL的10 mmol／L DTT。室溫下放置10 min，使DHA還原成As A。然后再加入100μL 0．5 mol／L的NEM，400μL的10% TCA，400μL的44%磷酸，400μL的4%雙吡啶和100μL的3%FeCl3。反應(yīng)混合液37℃溫浴1 h，在525 nm處讀取消光值。測定As A時(shí)，用100μL的dd H2O代替100μL的10 mmol／L DTT和50μL的0．5 mol／L NEM。用同樣方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總抗壞血酸和As A含量，DHA為總抗壞血酸與As A的差值。

1．4．4 還原型谷胱甘肽（GSH）含量測定 參考Kn?rzer等［23］的方法。0．2 m L上清液與0．1 m L的H2O混合用于測定總谷胱甘肽，0．2 m L的上清液與0．1 m L的2-乙烯吡啶（10%）混合用于測定氧化型谷胱甘肽（GSSG）。以上混合液在25℃中溫浴60 min。再加入1．4 m L的50 mmol／L PBS（含2．5 mmol／L EDTA，p H 7．5），160μL的12．5 mmol／L DTNB和50μL的10 mmol／L NADPH。用40μL的2．5 U／m L的Sigma公司商用GR在25℃啟動(dòng)反應(yīng)，測定412 nm下的吸光值變化。分別對GSH和GSSG制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。GSH含量由谷胱甘肽總含量和GSSG的差值獲得。

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

全部數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010和SPSS 17．0處理，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤（±SE）或進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 2，3-BD與2R，3R-BD處理對匍匐翦股穎接種立枯絲核菌病葉率的影響

接菌后隨時(shí)間延長，處理與對照的病葉率均呈上升趨勢，但250μmol／L的2，3-BD與100μmol／L的2R，3R-BD處理的病葉率明顯低于CK。接菌后發(fā)病明顯的第15天，CK的病葉率為91．67%，而2，3-BD與2R，3RBD處理的病葉率顯著低于CK，分別僅為15．67%和34%，同時(shí)，2，3-BD處理的病葉率顯著低于2R，3R-BD處理（圖1）。

2．2 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)APX活性的影響

接菌后APX活性呈先上升后下降趨勢。2，3-BD與2R，3R-BD明顯抑制了匍匐翦股穎APX活性（圖2）。其中接菌后第3，5，7，9天，CK的APX活性顯著高于2，3-BD處理（P＜0．05），分別是其1．21，1．05，1．28和1．09倍。CK的APX活性在接菌后第3，5，9天顯著高于2R，3R-BD處理（P＜0．05），分別是其1．05，1．05，1．51倍。2，3-BD與2R，3R-BD的APX活性出現(xiàn)差異，接菌后第1，9天除外，2R，3R-BD的APX活性均高于2，3-BD。

圖1 2，3-BD與2R，3R-BD處理后匍匐翦股穎發(fā)病率Fig．1 The rate of diseased plants of creeping bentgrass under 2，3-BD and 2R，3R-BD

圖2 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎抗壞血酸過氧化物酶活性的影響Fig．2 Effects of 2，3-BD and 2R，3R-BD treatment on ascorbate peroxidase（APX）of creeping bentgrass

2．3 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)GR活性的影響

接菌后GR活性呈先上升后下降趨勢，2，3-BD與2R，3R-BD明顯提高了病原菌入侵期間匍匐翦股穎體內(nèi)GR活性（圖3）。2，3-BD處理的GR活性在接菌后第1，3，5天顯著高于CK（P＜0．05），分別是其1．05，1．19，1．10倍。2R，3R-BD的GR活性在接菌后第1，3，5，9天顯著高于CK（P＜0．05），分別是其1．08，1．08，1．03，1．04倍。2，3-BD與2R，3R-BD的GR活性出現(xiàn)差異，其中第3，5天2，3-BD的GR活性顯著高于2R，3R-BD，而第1，9天2R，3R-BD的GR活性顯著高于2，3-BD（P＜0．05）。

2．4 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)As A含量的影響

As A含量在接菌后第1至3天出現(xiàn)小幅下降，第5至9天出現(xiàn)上升趨勢，2，3-BD與2R，3R-BD處理變化明顯（圖4）。接菌后第1天，2，3-BD處理的As A含量低于其他兩處理，在其他時(shí)間段均顯著高于CK（P＜0．05）。2R，3R-BD處理的As A含量在接菌后第2天出現(xiàn)最低值，在其他時(shí)間段均顯著高于CK（P＜0．05）。2，3-BD與2R，3R-BD的As A含量出現(xiàn)差異，2R，3R-BD在第1，5，9天顯著高于2，3-BD，而2，3-BD僅在第3天顯著高于2R，3R-BD（P＜0．05）。

2．5 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)DHA含量的影響

DHA含量變化也呈先上升后下降，之后再次上升的趨勢（圖5）。其中，接菌后第5天除外，2，3-BD處理的DHA含量均顯著高于CK（P＜0．05）。2R，3R-BD的DHA均高于CK，其中第5，7天差異顯著（P＜0．05），分別是CK的1．82和1．20倍。2，3-BD與2R，3R-BD的DHA含量出現(xiàn)差異，其中，接菌后第1，3，7，9天，2，3-BD的DHA均顯著高于2R，3R-BD（P＜0．05），分別是其1．64，1．50，1．18，1．45倍。

2．6 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)As A／DHA的影響

2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)As A／DHA有顯著影響，As A／DHA呈先上升后下降趨勢，但CK的變化幅度不大（圖6）。2，3-BD的As A／DHA在接菌后第5天上升至最高峰，且顯著大于2R，3R-BD與CK（P＜0．05），分別是其1．4和5．0倍。接菌后第3天除外，2R，3R-BD的As A／DHA均大于CK，其中第5，7天差異顯著（P＜0．05），分別是其3．4和3．5倍。2，3-BD與2R，3R-BD的As A／DHA除在第5天出現(xiàn)差異外，在第1，7，9天2R，3R-BD的As A／DHA顯著大于2，3-BD（P＜0．05）。

圖3 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎谷胱甘肽還原酶活性的影響Fig．3 Effects of 2，3-BD and 2R，3R-BD treatment on glutathione reductase（GR）of creeping bentgrass

圖4 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎還原型抗壞血酸含量的影響Fig．4 Effects of 2，3-BD and 2R，3R-BD treatment on ascorbic acid（AsA）content of creeping bentgrass

圖5 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎脫氫抗壞血酸含量的影響Fig．5 Effects of 2，3-BD and 2R，3R-BD treatment on dehydroascorbic acid（DHA）content of creeping bentgrass

圖6 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎AsA／DHA的影響Fig．6 Effects of 2，3-BD and 2R，3R-BD treatment on AsA／DHA of creeping bentgrass

2．7 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)GSH含量的影響

GSH含量在接菌后呈緩慢上升趨勢（圖7）。接菌后第7天除外，2，3-BD的GSH均顯著高于CK（P＜0．05）。2R，3R-BD的GSH在接菌后各時(shí)間段均高于CK，其中第1，7，9天差異顯著（P＜0．05），分別是CK的1．48，1．15，1．77倍。2，3-BD與2R，3R-BD出現(xiàn)差異，接菌后第7天除外，2，3-BD的GSH均顯著高于2R，3RBD。

2．8 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)GSSG含量的影響

2，3-BD與2R，3R-BD對GSSG沒有明顯影響，接菌后3個(gè)處理GSSG含量變化沒有顯著差異（圖8）。接菌后第5天除外，2，3-BD的GSSG含量均高于CK，但差異不顯著（P＞0．05）。2R，3R-BD的GSSG在接菌后第5，7，9天高于CK，僅第5天出現(xiàn)顯著差異（P＜0．05）。

圖7 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎GSH的影響Fig．7 Effects of 2，3-BD and 2R，3R-BD treatment on GSH of creeping bentgrass

圖8 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎氧化型谷胱甘肽含量的影響Fig．8 Effects of 2，3-BD and 2R，3R-BD treatment on L-glutathione oxidized（GSSG）of creeping bentgrass

圖9 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎GSH／GSSG的影響Fig．9 Effects of 2，3-BD and 2R，3R-BD treatment on GSH／GSSG of creeping bentgrass

2．9 2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎體內(nèi)GSH／ GSSG含量的影響

接菌后GSH／GSSG呈上升趨勢，在第7至9天達(dá)高峰（圖9）。2，3-BD與2R，3R-BD對匍匐翦股穎GSH／GSSG具有顯著影響。接菌后第7天除外，2，3-BD的GSH／GSSG均高于CK，其中第3，9天差異顯著（P＜0．05），分別是其2．12，2．34倍。2R，3R-BD的GSH／GSSG在第1，3，9天高于CK，第9天差異顯著（P＜0．05），是其1．66倍。2，3-BD與2R，3R-BD的GSH／GSSG出現(xiàn)差異，2，3-BD在第9天出現(xiàn)最大峰值，且分別在第3，9天顯著大于2R，3R-BD（P＜0．05）。

3 討論

3．1 不同濃度2，3-BD與2R，3R-BD作用后匍匐翦股穎發(fā)病率分析

本研究結(jié)果表明，接菌后發(fā)病明顯的第15天，250μmol／L的2，3-BD與100μmol／L的2R，3R-BD病葉率顯著低于對照，說明兩種誘導(dǎo)劑能夠有效誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病。Han等［13］設(shè)置不同濃度2R，3R-BD誘導(dǎo)煙草的ISR，結(jié)果表明，2R，3R-BD的劑量為100μg／株時(shí)抵抗軟腐?。‥.carotovora）效果最佳，當(dāng)劑量小于10μg／株時(shí)不能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生ISR。Cortes-Barco等［12］的研究表明，100μmol／L的2R，3R-BD可誘導(dǎo)本氏煙草抗炭疽?。–olletotricium orbiculare）葉面病害面積降低77%。本研究結(jié)果與上述研究報(bào)道有共同之處。本結(jié)果表明2，3-BD及其同分異構(gòu)體在一定濃度范圍以ISR方式誘導(dǎo)匍匐翦股穎產(chǎn)生抗病性。值得重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)的是2，3-BD與2R，3R-BD兩種新型抗病誘導(dǎo)劑具有抗性穩(wěn)定、持久、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。適宜濃度誘導(dǎo)劑產(chǎn)品的研發(fā)與應(yīng)用將為開展節(jié)能、環(huán)保和低碳的草坪管理提供新途徑。

3．2 抗壞血酸及APX參與2，3-BD、2R，3R-BD誘導(dǎo)后匍匐翦股穎的抗病過程

As A作為一種還原性物質(zhì)參與植物體氧化還原過程，不僅通過減少或清除某些有害自由基對植物起保護(hù)作用［24］，還參與誘導(dǎo)SA合成的信號(hào)傳遞，如SAR機(jī)制誘導(dǎo)劑SA處理后黃瓜葉片中As A、DHA含量顯著增加，殼聚糖誘導(dǎo)臍橙抗青霉病的同時(shí)延緩果實(shí)As A含量下降［15，18，25］。本研究結(jié)果表明，250μmol／L的2，3-BD與100μmol／L的2R，3R-BD能夠有效誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病的同時(shí)，As A與DHA含量明顯高于CK，在接菌后第3天，2，3-BD與2R，3R-BD的As A／DHA達(dá)到最大值，分別是CK的5．0和3．4倍。Conklin和Barth［16］的研究認(rèn)為，As A氧化態(tài)與還原態(tài)的不平衡會(huì)誘導(dǎo)脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）來調(diào)節(jié)SAGs（Senescence assiciated genes）和PRs表達(dá)，從而提高植物體抗病性。誘導(dǎo)劑2，3-BD與2R，3R-BD以ISR方式誘導(dǎo)植物產(chǎn)生較強(qiáng)的防御反應(yīng)，抗壞血酸的兩種存在形態(tài)As A、DHA參與此過程，這與SAR方式誘導(dǎo)劑有類似之處。

APX主要存在于葉綠體，As A作為電子供體經(jīng)APX催化將葉綠體中產(chǎn)生的H2O2還原為H2O，抑制H2O2積累的同時(shí)自身氧化為DHA。SA處理緩解輪紋病（Physalosproa piricola）時(shí)，APX活性與對照相比提高了21．11%［26］，而殼聚糖誘導(dǎo)柑橘抗炭疽病過程中APX活性受到抑制［23］。本研究中，2，3-BD和2R，3R-BD與CK的APX活性出現(xiàn)明顯上升趨勢，但在此過程中，兩處理的APX活性略低于CK，可能是APX用于防止過量活性氧對細(xì)胞產(chǎn)生傷害的同時(shí)又確保活性氧在直接抑菌、細(xì)胞壁強(qiáng)度增強(qiáng)、誘導(dǎo)植保素合成及誘導(dǎo)防衛(wèi)基因表達(dá)等植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮作用［27-29］。

3．3 谷胱甘肽及GR參與2，3-BD、2R，3R-BD誘導(dǎo)后匍匐翦股穎的抗病過程

As A的再生循環(huán)與As A-GSH循環(huán)中GR活性密切相關(guān)，GR活性提高，促進(jìn)DHA還原為As A，也催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為還原型谷胱甘肽（GSH），在此過程中GSH直接或間接調(diào)控活性氧合成，同時(shí)也作為信號(hào)分子介導(dǎo)植物體防御反應(yīng)，誘導(dǎo)防御基因表達(dá)，如參與NPR1基因依賴的SA信號(hào)途徑［17，30］。本研究結(jié)果表明，2，3-BD與2R，3R-BD有效提高病原菌入侵期間匍匐翦股穎體內(nèi)GSH含量，在第7～9天出現(xiàn)最高峰值，兩處理的GSH含量高于CK，但處理與對照間GSSG含量差異不顯著，且在第7天出現(xiàn)下降，可能是GR活性增強(qiáng)，將過多GSSG還原為GSH。GSH／GSSG是谷胱甘肽活性的重要指標(biāo)之一。本研究中2，3-BD與2R，3R-BD能夠明顯提高GSH／GSSG，在第9天達(dá)最大峰值，分別是CK的2．34和1．66倍。在對擬南芥的研究表明，GSH在與JA相關(guān)基因表達(dá)的信號(hào)途徑中起調(diào)控作用，而JA是ISR過程中的關(guān)鍵信號(hào)分子［31］。SAR方式誘導(dǎo)水楊酸類似物（INA，isonicotiniac acid）與丁香疫霉病菌（P.syringae）共同處理誘導(dǎo)產(chǎn)生SAR，谷胱甘肽總量和GSH／GSSG也呈上升趨勢［32］。這表明GSH在ISR、SAR過程中參與調(diào)節(jié)活性氧代謝平衡的同時(shí)，更重要的作用是作為信號(hào)分子參與誘導(dǎo)抗病基因表達(dá)。不僅植物體內(nèi)的GSH可在植物抗病中發(fā)揮作用，研究還發(fā)現(xiàn)外源GSH刺激菜豆懸浮細(xì)胞抗病防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)控植保素積累［33-34］。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，植物抗病誘導(dǎo)劑2，3-BD與2R，3R-BD，以ISR機(jī)制能夠有效誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗褐斑病過程中，As A-GSH循環(huán)參與此抗病反應(yīng)。As A含量在接菌初期處于較低水平，后期明顯上升，GSH含量顯著提高，As A／DHA及GSH／GSSG均不同程度提高。說明誘導(dǎo)劑處理后匍匐翦股穎的抗病反應(yīng)中，As A與GSH作為活性氧清除劑參與活性氧代謝的同時(shí)，也參與ISR抗病信號(hào)的傳導(dǎo)，但2，3-BD與2R，3R-BD誘導(dǎo)的ISR中，As A與GSH在JA／ET信號(hào)途徑中如何發(fā)揮作用，需要更進(jìn)一步的研究。

［1］ He Q，Liu J X．Advances in fungi disease research on turfgrasses．Pratacultural Science，2006，23（4）：95-104．

［2］ Wen K J，Luo T Q，Zhang L，et al．Control efficacy of 6 fungicides against 3 pathogens of turfgrass disease．Acta prataculturae Sinica，2013，22（3）：124．

［3］ Zhang L，Hu F R，Shen X H，et al．Advances in turfgrass biotechnology and hot research topics．Acta Agriculturae Nucleatae Sinica，2004，18（5）：372-375．

［4］ Zhang C X，Nan Z B，Li C J，et al．Studies progress of fungicide seed treatments on the control of turfgrass diseases．Acta Prataculturae Sinica，2005，14（6）：14-22．

［5］ Guo J F，Pan J S，Wang C，et al．Research on relationships of pathogenesis-related proteins with plant disease resistance and their application in turfgrass disease resistance breeding．Acta Prataculturae Sinica，2008，17（6）：156．

［6］ Godard J，Ziadi S，Monot C，et al．Benzothiadiazole（BTH）induces resistance in cauliflower（Brassica oleracea var．botrytis）to downy mildew of crucifers caused by Peronospora parasitica．Crop Protection，1999，18（6）：397-405．

［7］ Colson-Hanks E S，Deverall B J．Effect of 2，6-dichloroisonicotinic acid，its formulation materials and benzothiadiazole on systemic resistance to alternaria leaf spot in cotton．Plant Pathology，2000，49（2）：171-178．

［8］ Walters D，Newton A，Lyon G．Induced Resistance for Plant Defence［M］．Oxford：Blackwell Publishing，2007：31-81．

［9］ Suzuki S，He Y，Oyaizu H．Indole-3-acetic acid production in Pseudomonasfluorescens HP72 and its association with suppression of creeping bentgrass brown patch．Current Microbiology，2003，47（2）：138-143．

［10］ Ryu C，F(xiàn)arag M A，Hu C，et al．Bacterial volatiles induce systemic resistance in Arabidopsis．Plant Physiology，2004，134（3）：1017-1026．

［11］ Cortes-Barco A M，Hsiang T，Goodwin P H．Induced systemic resistance against three foliar diseases of Agrostisstolonifera by（2R，3R）-butanediol or an isoparaffin mixture．Annals of Applied Biology，2010，157（2）：179-189．

［12］ Cortes-Barco A M，Goodwin P H，Hsiang T．Comparison of induced resistance activated by benzothiadiazole，（2R，3R）-butanediol and an isoparaffin mixture against anthracnose of Nicotiana benthamiana．Plant Pathology，2010，59（4）：643-653．

［13］ Han S H，Lee S J，Moon J H，et al．GacS-dependent production of 2R，3R-butanediol by Pseudomonas chlororaphis O6 is a major determinant for eliciting systemic resistance against Erwinia carotovora but not against Pseudomonas syringae pv．tabaci in tobacco．Molecular Plant-Microbe Interactions，2006，19（8）：924-930．

［14］ Smith A G，Croft M T，Moulin M，et al．Plants need their vitamins too．Current Opinion in Plant Biology，2007，10（3）：266-275．

［15］ Kuzniak E，Skl Z S，Odowska M．Ascorbate，glutathione and related enzymes in chloroplasts of tomato leaves infected by Botrytis cinerea．Plant Science，2001，160（4）：723-731．

［16］ Conklin P L，Barth C．Ascorbic acid，a familiar small molecule intertwined in the response of plants to ozone，pathogens，and the onset of senescence．Plant，Cell＆Environment，2004，27（8）：959-970．

［17］ Ghanta S，Bhattacharyya D，Chattopadhyay S．Glutathione signaling acts through NPR1-dependent SA-mediated pathway to mitigate biotic stress．Plant Signal＆Behavior，2011，6（4）：607-609．

［18］ Deng Y Y，Ming J，Zhang Z Q，et al．Effect of chitosan on salicylic acid and active oxygen metabolism of navel orange fruit．Scientia Agricultura Sinica，2010，（04）：812-820．

［19］ Ren J Z．Grassland Research Methods［M］．Beijing：China Agriculture University Press，1998：214-236．

［20］ Nakano Y，Asada K．Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts．Plant and Cell Physiology，1981，22（5）：867-880．

［21］ Foyer C H，Halliwell B．The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts：a proposed role in ascorbic acid metabolism．Planta，1976，133（1）：21-25．

［22］ Kampfenkel K，Van Montagu M，Inze D．Extraction and determination of ascorbate and dehydroascorbate from plant tissue．Analytical Biochemistry，1995，225（1）：165-167．

［23］ Kn?rzer O C，Burner J，Boger P．Alterations in the antioxidative system of suspension-cultured soybean cells（Glycine max）induced by oxidative stress．Physiologia Plantarum，1996，97（2）：388-396．

［24］ Chen L F，Ye M B，Chen Y X，et al．The relationship between ascorbic acid and resistance of wheat to scab．Acta Phytopathologia Sinica，1997，27（2）：113-118．

［25］ Shi Q H，Zhu Z J，Xu M，et al．Effects of exogenous salicylic acid on activities of some enzymes and antioxidants in cucumber leaves．Acta Horticulturae Sinica，2004，（05）：666-667．

［26］ Liu Z L，Zhang S L，Gao F Y．Effect of exogenous salicylic acid on antioxidant enzymes and Ca2＋density in pear leaves infected by Physalosproa piricola Nose．Chinese Journal of Applied＆Environmental Biology，2011，17（2）：215-218．

［27］ Bradley D J，Kjellbom P，Lamb C J．Elicitor-and wound-induced oxidative cross-linking of a proline-rich plant cell wall protein：a novel，rapid defense response．Cell，1992，70（1）：21-30．

［28］ Desikan R，Reynolds A，Hancock J T，et al．Harpin and hydrogen peroxide both initiate programmed cell death but have differential effects on defence gene expression in Arabidopsis suspension cultures．Biochemical Journal，1998，330（1）：115-120．

［29］ Rogers K R，Albert F，Anderson A J．Lipid peroxidation is a consequence of elicitor activity．Plant Physiology，1988，86（2）：547-553．

［30］ Mhamdi A，Hager J，Chaouch S，et al．Arabidopsis glutathione reductase1 plays a crucial role in leaf responses to intracellular hydrogen peroxide and in ensuring appropriate gene expression through both salicylic acid and jasmonic acid signaling pathways．Plant Physiology，2010，153（3）：1144-1160．

［31］ Foyer C H，Noctor G．Redox homeostasis and antioxidant signaling：a metabolic interface between stress perception and physiological responses．Plant Cell，2005，17（7）：1866-1875．

［32］ Mou Z，F(xiàn)an W，Dong X．Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes．Cell，2003，113（7）：935-944．

［33］ Vanacker H，Carver T L，F(xiàn)oyer C H．Early H2O2accumulation in mesophyll cells leads to induction of glutathione during the hyper-sensitive response in the barley-powdery mildew interaction．Plant Physiology，2000，123（4）：1289-1300．

［34］ Ma H L，F(xiàn)ang Y Y．Induction of plant disease resistance and its application for disease control in creeping bentgrass．Acta Prataculturae Sinica，2014，23（5）：312-320．

參考文獻(xiàn)：

［1］ 何秋，劉建秀．草坪草真菌病害的研究進(jìn)展．草業(yè)科學(xué)，2006，23（4）：95-104．

［2］ 文克儉，羅天瓊，張莉，等．種殺菌劑對3種禾草病害的防治研究．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（3）：124．

［3］ 張磊，胡繁榮，沈希宏，等．草坪草生物技術(shù)進(jìn)展及研究熱點(diǎn)．核農(nóng)學(xué)報(bào)，2004，18（5）：372-375．

［4］ 張成霞，南志標(biāo)，李春杰，等．殺菌劑拌種防治草坪草病害的研究進(jìn)展．草業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（6）：14-22．

［5］ 郭金芳，潘俊松，王琛，等．病程相關(guān)蛋白與植物抗病性關(guān)系的研究及其在草坪草抗病育種中的應(yīng)用．草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（6）：156．

［18］ 鄧雨艷，明建，張昭其，等．殼聚糖誘導(dǎo)臍橙果實(shí)抗病性、水楊酸及活性氧代謝變化．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（4）：812-820．

［19］ 任繼周．草業(yè)科學(xué)研究方法［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：214-236．

［24］ 陳利鋒，葉茂炳，陳永幸，等．抗壞血酸與小麥抗赤霉病性的關(guān)系．植物病理學(xué)報(bào)，1997，27（2）：113-118．

［25］ 史慶華，朱祝軍，徐敏，等．外源水楊酸對黃瓜葉片幾種酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響．園藝學(xué)報(bào)，2004，（5）：666-667．

［26］ 劉招龍，張紹鈴，高富永．外源水楊酸對梨葉片感染輪紋病菌后抗氧化酶活性及Ca2＋濃度的影響．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2011，17（2）：215-218．

［34］ 馬暉玲，房媛媛．植物抗病性及其誘導(dǎo)抗性在匍匐翦股穎病害防治中的應(yīng)用．草業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23（5）：312-320．

Involvement of the ascorbate-glutathione cycle in resistance of creeping bentgrass to Rhizoctonia solani induced by 2，3-butanediol and 2R，3R-butanediol

FANG Yuan-Yuan，MA Hui-Ling*
Pratacultural College，Gansu Agricultural University，Key Laboratory of Grassland Ecosystem，Ministry of Education，Sino-U.S.Centersfor Grazingland Ecosystem Sustainability，Lanzhou 730070，China

The compounds 2，3-butanediol（BD）and 2R，3R-BD can cause creeping bentgrass to show increased resistance against Rhizoctonia solani．To evaluate the mechanisms of this induced resistance，we determined the activities of antioxidant enzymes in the ascorbate-glutathione cycle and the redox states of various antioxidant compounds in leaves of creeping bentgrass that were injected with 250μmol／L 2，3-BD and 100μmol／L 2R，3R-BD before inoculation with R.solani．The 2，3-BD and 2R，3R-BD treatments significantly decreased the disease incidence in creeping bentgrass plants inoculated with R.solani and increased the activities of glutathione reductase（GR）and ascorbate peroxidase（APX）．However，the increase in APX activity was smaller than that in the control（no BD）．In the plants treated with 2，3-BD and 2R，3R-BD，the ascorbic acid（As A）content decreased at an early stage and increased at a later stage after inoculation，while the content of de-hydroascorbic acid（DHA）peaked at 1 and 9 d after inoculation at levels significantly higher than those in the control．The As A／DHA ratios of plants treated with 2，3-BD and 2R，3R-BD reached a maximum at 5 days after inoculation（5．0 and 3．4 times the As A／DHA ratio in the no-BD control at 5 d after inoculation，respectively）．In plants treated with 2，3-BD and 2R，3R-BD，the glutathione（GSH）content significantly increased and the GSH／GSSG ratios peaked at 9 days after inoculation at 2．34 and 1．66 times that in the no-BD control，respectively．These results suggest that in creeping bentgrass，the resistance against R.solani induced by 2，3-BD and 2R，3R-BD involves the ascorbate-glutathione cycle，which maintains efficient metabolism and participates in the plant disease resistance response．

creeping bentgrass；2，3-BD；2R，3R-BD；Rhizoctonia solani

10．11686／cyxb2014519 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

房媛媛，馬暉玲．As A-GSH循環(huán)參與2，3-丁二醇、2R，3R-丁二醇誘導(dǎo)后匍匐翦股穎的抗病反應(yīng)．草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（11）：82-90．

FANG Yuan-Yuan，MA Hui-Ling．Involvement of the ascorbate-glutathione cycle in resistance of creeping bentgrass to Rhizoctonia solani induced by 2，3-butanediol and 2R，3R-butanediol．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（11）：82-90．

2014-12-15；改回日期：2015-03-10

國家自然科學(xué)基金（丁二醇誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗病性及其ISR機(jī)理研究-31360583）資助。

房媛媛（1988-），女，甘肅蘭州人，在讀碩士。E-mail：estherfyy＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：mahl＠gsau．edu．cn