薛寶瑤，趙 靜，張西愿，姜 霞，周 卓，于月成

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710032)

SDF-1α通過p38MAPK-HIF-1α通路加強卵巢癌細胞轉移的機制探討

薛寶瑤，趙 靜，張西愿，姜 霞，周 卓，于月成

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710032)

目的 明確缺氧誘導因子-lα(HIF-1α)在基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)調控的卵巢癌細胞遷移中的作用及其機制。方法 采用免疫組化分析HIF-1α在卵巢癌組織中的表達水平；將HIF-1α siRNA轉染SKOV3卵巢癌細胞，分別用SDF-1α和SDF-1α+SB203580處理，用RT-PCR及western blotting分析HIF-1α、p38MAPK的表達水平。結果 免疫組化分析表明，HIF-1α在卵巢癌組織中高表達，同時SDF-1α可明顯誘導HIF-1α的mRNA及蛋白水平的表達；當用HIF-1α siRNA轉染后，細胞中HIF-1α的表達水平明顯下降。當用通路抑制劑SB203580處理后，SDF-1α誘導的HIF-1α水平明顯降低。結論 SDF-1α可通過p38MAPK-HIF-1α通路來調控卵巢癌細胞的遷移。因此，該研究將為卵巢癌的防治提供新的研究方向。

基質細胞衍生因子-1α；絲裂原活化蛋白激酶通路；缺氧誘導因子-lα；卵巢癌；細胞遷移

基質細胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1 alpha，SDF-1α)(趨化因子CXCL12)在腫瘤的發(fā)病機制中起著重要的作用，然而其具體的機制仍然不明。缺氧誘導因子-lα(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)被認為在參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生物學方面起到重要作用，其源于HIF-1α上調了SDF-1α表達促進了干細胞黏附、遷移[1]。本研究主要觀察和分析SDF-1α激活PI3K/AKT和MAPK通路促進HIF-1α的表達，從而促進卵巢癌細胞的轉移，明確卵巢癌轉移機制，有望為卵巢癌的靶向治療提供新思路及臨床指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞SKOV3由第四軍醫(yī)大學細胞工程中心提供，McCoy’5A培養(yǎng)基購自Gibic；兔抗人HIF-lα多克降抗體、兔抗人p38、pp38多克隆抗體、SB203580購自美國Santa cruz公司，兔抗人β-actin抗體購自上海生工生物工程有限公司，DAB顯色劑(棕色)購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；脂質體LipofeetamineTM 2000購自Invitroge，HIF-1α基因干擾片段由大連寶生物工程有限公司設計合成；TRIzol試劑、real-time RT-PCR試劑盒購自TaKaRa，HIF-1α mRNA引物由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理

將人卵巢癌細胞SKOV3置于含10%胎牛血清McCoy’5A培養(yǎng)基，37℃以及含有5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，分為3組：A組卵巢癌細胞control，B組卵巢癌細胞加入外源SDF-1α，C組細胞轉染HIF-1α siRNA或細胞培養(yǎng)基中加入SB203580。

1.2.2 免疫組化染色

收集第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院病理科卵巢癌患者石蠟組織塊，制備切片，將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫滅活內源性過氧化酶20min，枸櫞酸鈉煮沸修復抗原20min，加入兔抗人SDF-1α單克隆抗體、兔抗人HIF-1α單克隆抗體(1:200、4℃、過夜)，PBS洗片后二抗封閉40min，鏈霉親和素-過氧化物酶封閉40min，DAB顯色，蘇木素襯染、脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 缺氧誘導因子-1α沉默RNA轉染

調整濃度SKOV3細胞(8～10)×104/L接種至6孔板，在含10%胎牛血清的McCoy’5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，細胞匯合度達到90%～95%。將稀釋好的HIF-1α siRNA和Lipofeetamine 2000試劑混合，形成HIF-1α siRNA/Lipofectamine 2000復合物。將HIF-1αsiRNA轉染載體加到含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中融合，然后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6h后換含10%胎牛血清的McCoy’5A培養(yǎng)基，20h恢復生長后，轉染空白質粒Lipofeetamine 2000組作為對照，利用Western Blot檢測轉染效率。

1.2.4 實時熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應檢測

TRIzol法提取6孔板內各組細胞的總RNA并定量；各樣本取3ng～3g總RNA，按TaKaRa公司試劑盒說明進行逆轉錄合成eDNA。應用實時熒光定量RT-PCR檢測，β-actin作為內參照。PCR引物：HIF-1α正義鏈5-TTGCTCAT￣CAGTT￣GCCACTTCC-3，反義鏈5-AGCAATTCATCTGT￣GCTTTCATGTC-3。具體實驗過程參考TaKaRa公司的real-time RT-PCR試劑盒進行。

1.2.5 蛋白印跡法檢測

將細胞懸液經(jīng)離心、純化，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，勻漿中的各種成分會在凝膠中分開。之后，將凝膠中的蛋白質轉移到PVDF (polyvinylidene difluoride)膜上，加入第一抗體，孵育24h后，再加入第二抗體，后加入ECL (enhancer chemiluminescence)加強發(fā)光反應。最后，將“膜”與X線片相重疊，反應發(fā)出的光就會使X線片曝光，沖洗后可見所選擇蛋白所在的位置。通過蛋白印跡法檢測細胞中p38/pp38以及HIF-1α的表達水平。

2 結果

2.1 缺氧誘導因子-1α在上皮性卵巢癌組織中的表達水平

免疫組化分析表明，HIF-1α在9例正常卵巢中無陽性表達，陽性表達率為0；HIF-1α在97例卵巢癌患者組織中65例呈陽性表達，陽性表達率為67.0%,HIF-1α在上皮性卵巢癌中的表達見圖1A、圖1B。

2.2 基質細胞衍生因子-1α誘導缺氧誘導因子-1α的表達

RT-PCR分析表明，SDF-1α刺激后可明顯誘導人卵巢癌細胞SKOV3中HIF-1α的mRNA水平，見圖2，表明SDF-1α能夠促使卵巢癌細胞表達HIF-1α。

2.3 缺氧誘導因子-1α沉默RNA轉染對細胞中缺氧誘導因子-1α表達水平的影響

Western blotting分析表明，HIF-1α siRNA轉染后細胞中HIF-1α的蛋白水平明顯下降，見圖3，提示成功構建HIF-1α沉默的細胞模型。

圖1A 圖1B

注：圖1A為陰性對照(SP×400)；圖1B為HIF-1α在卵巢癌患者組織中的陽性表達(SP×400)。

圖1 缺氧誘導因子-1α在上皮性卵巢癌中的表達

Fig.1 Expression of HIF-1α in ovarian cancer

圖2A 圖2B

注：圖2A為每組中20ng/mL SDF-1α 0、2、4、6和8h后各組中HIF-1α的mRNA水平；圖2B為每組中加入SDF-1α分別0、1、10、20和50ng/mL后各組中HIF-1α的mRNA水平。

圖2 SDF-1α誘導的HIF-1α在卵巢癌細胞株SKOV3中的表達水平

Fig.2 Expression level of HIF-1α induced by SDF-1α. in ovarian cancer cell line SKOV3

圖3 各組細胞中HIF-1α的蛋白表達水平

Fig.3 Protein expression levels of HIF-1α in each cell group

2.4 p38絲裂原活化蛋白激酶在基質細胞衍生因子-1α/缺氧誘導因子-1α誘導的卵巢癌細胞遷移中的作用

進一步分析SDF-1α/HIF-1α誘導卵巢癌細胞遷移的作用機制，Western分析表明，SDF-1α誘導p38MAPK的活化，見圖4A。當用p38MAPK通路抑制劑SB203580處理后，細胞中SDF-1α誘導的HIF-1α的表達水平明顯受到抑制，見圖4B。

注：圖4A為各組細胞中pp38、p38的蛋白表達水平；圖4B為各組細胞中HIF-1α的蛋白表達水平。

圖4 pp38、p38及HIF-1α的蛋白表達水平

Fig.4 Protein expression levels of pp38, p38 and HIF-1α in each cell group

3 討論

3.1 趨化因子CXCR及其受體

趨化因子CXC受體(CXCR)是Gt類趨化因子，定位于第4號染色體，是完整的膜蛋白，可與CXC趨化因子家族成員特異性結合。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)哺乳動物有7種趨化因子受體，分別被命名為CXCRl～CXCR7。CXCRl和CXCR2密切相關，CXCRl的配基是人類CXCL8[也稱為白細胞介素(IL)-8]和CXCL6。CXCR2與CXCLl～CXCL7結合，CXCRl和CXCR2均表達在中性粒細胞表面，對中性粒細胞的趨化具有重要意義。CXCR3主要表達在T淋巴細胞和某些B淋巴細胞及自然殺傷細胞，細胞被激活后高表達，CXCR3有2種同種型：CXCR3-A和CXCR3-B，有3種高選擇性配基：CXCL9、CXCLl0和CXCLl 1(IFN 7、7 IP-10和Mig)，7 IP-10和Mig是CXC趨化因子超家族的2個成員，IFN 7可以極大程度地上調它們的表達。7 IP-10和Mig是CXCR3的功能性激動劑。這兩種蛋白對NK細胞和活化T細胞有很強的激活作用，還介導IFN 7和脂多糖的作用及介導T細胞依賴的抗腫瘤作用[2]，趨化因子擁有40～50種蛋白質的家族，CXCR與SDF-1α(基質細胞來源因子，又名CXCL12)均為GPCR家族成員[3]，廣泛分部在中性粒細胞、T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、朗格漢斯細胞以及樹突狀細胞等造血細胞上。趨化因子對腫瘤發(fā)展進程的調控主要通過與其受體結合完成的，趨化因子授予G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體超家族。SDF-1α作為趨化因子家族成員之一，具有參與腫瘤細胞趨化性、血管生成及腫瘤轉移的功能，已成為近些年來的研究熱點。目前已有大量實驗研究表明SDF-1α在多種癌癥中均有表達，可通過與其相應的受體結合活化下游的信號通路，從而促進了癌癥的侵襲、轉移[4]。本研究前期實驗已證明SDF-1α通過與其受體CXCR4結合形成SDF-1α/CXCR4生物軸誘導的卵巢癌細胞的侵襲性與αvβ6的表達相關，αvβ6整合素通過活化p38 MAPK及PI3K/Akt信號通路誘導下游uPA的表達，進而促進卵巢癌細胞的侵襲性[5]。

3.2 缺氧誘導因子-1α及其與基質細胞衍生因子-1α之間的關系

HIF-1α被認為是缺氧狀態(tài)下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種關鍵的轉錄因子，它可激活相關目的基因的轉錄，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。HIF-1α是由826個氨基酸組成，N端具有一個堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構域(bHLH)和一個PAS(Per-ARNT-Sim)結構域，這兩種結構域共同參與靶基因上的低氧反應元件結合，引起一系列反應，利于腫瘤在缺氧條件下的能量代謝和氧輸送，為腫瘤的生長和轉移提供基礎。已有研究證明HIF-1α在卵巢癌組織中表達，提示HIF-1α對卵巢上皮癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用[6]。Mi-Kyoung Kim等[7]已證實，HIF-1α表達量的增加是依賴其上游的p38 MAPK信號通路的活化。

本實驗設想SDF-1α是否可通過p38 MAPK-HIF-1α通路來調控卵巢癌細胞的遷移。結果顯示：HIF-1α在卵巢癌患者組織中的陽性表達率明顯增高，提示HIF-1α可能在卵巢癌的進程中起著重要作用；RT-PCR分析表明，SDF-1α刺激后可明顯誘導人卵巢癌細胞SKOV3中HIF-1α的mRNA水平，表明SDF-1α能夠促使卵巢癌細胞表達HIF-1α；Western分析表明，SDF-1α誘導p38 MAPK的活化，當用p38 MAPK通路抑制劑SB203580處理后，細胞中SDF-1α誘導的HIF-1α的表達水平明顯受到抑制，提示SDF-1α通過激活p38 MAPK信號通路促進其下游的HIF-1α表達，從而促進卵巢癌細胞轉移。本研究明確了SDF-1α通過p38 MAPK-HIF-1α通路促進卵巢癌細胞轉移的機制，從而更好地為卵巢癌的靶向治療提供新的思路，對臨床診療起重要指導意義。

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[專業(yè)責任編輯：安瑞芳]

Stromal cell-derived factor-1 alpha(SDF-1α) enhances cells invasion by p38MAPK-HIF-1α mediated signaling in ovarian cancer

XUE Bao-yao, ZHAO Jing, ZHANG Xi-yuan, JIANG Xia, ZHOU Zhuo, YU Yue-cheng

(DepartmentofObstetricsandGynecology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To observe the role and mechanism of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) in ovarian cancer cell migration regulated by stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-1α). Methods The expression of HIF-1α in cervical cancer was analyzed by immunohistochemistry. HIF-1α siRNA was transfected into ovarian cancer cell line SKOV3, and then treated with SDF-1α and SDF-1α+SB203580, respectively. The expression levels of HIF-1α and p38MAPK were confirmed by RT-PCR and western blotting. Results Immunohistochemical analysis showed that the expression of HIF-1α in ovarian cancer tissues was overexpressed, and that at the same time SDF-1α could induce the expression of mRNA and protein levels in HIF-1α. After transfected by HIF-1α siRNA, the HIF-1α expression level decreased obviously. When treated by SB203580, the expression level of HIF-1α induced by SDF-1α decreased significantly. Conclusion SDF-1α can regulate cells invasion by p38MAPK-HIF-1α mediated signaling in ovarian cancer. Therefore, this study will provide a new research direction for prevention and treatment of ovarian cancer.

stromal cell-derived factor-1 alpha(SDF-1α)；MAPK pathway；hypoxia inducible factor-1α；ovarian cancer；cells invasion

2014-07-09

薛寶瑤(1988-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

于月成，副教授/副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.025

R737.33

A

1673-5293(2015)02-0243-03