周素銳，張文萍，李少南，朱國念

浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州 310029

利用N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶含量評價(jià)農(nóng)藥對花翅搖蚊種群發(fā)育的影響

周素銳，張文萍，李少南*，朱國念

浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州 310029

為了進(jìn)一步探索種群水平的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估方法，本文利用β-N-Acetyl-D-glucosaminidase(NAGase)的變化量來監(jiān)測農(nóng)藥對搖蚊種群發(fā)育的影響。從花翅搖蚊Chironomus kiiensis體內(nèi)分離純化得到電泳純的NAGase，并通過免疫大白兔制得NAGase的多克隆抗體。運(yùn)用間接非競爭ELISA法檢測抗體特異性，結(jié)果表明其與共同存在于水體的一些生物的NAGase的交叉反應(yīng)率為隆線溞4.41%、老年低額溞3.12%、多刺裸腹溞3.40%、中華薄殼介4.17%、日本沼蝦3.23%、白紋伊蚊7.50%、小球藻<0.5%。運(yùn)用抗體測得毒死蜱、氰戊菊酯和阿維菌素3種殺蟲劑對于搖蚊NAGase釋放量的12 d-EC50分別為1.2012、0.0043和0.6281μg·L-1，以NAGase活力作為測試終點(diǎn)，測得相應(yīng)的12 d-EC50：1.4765、0.0051和0.6756 μg·L-1，兩者差異不顯著，但均顯著低于以死亡作為測試終點(diǎn)的12 d-LC50：4.8171、0.0954和2.1340 μg·L-1，且毒力大小均為氰戊菊酯>阿維菌素>毒死蜱。上述結(jié)果表明，利用NAGase多克隆抗體可以特異性地檢測農(nóng)藥對花翅搖蚊種群發(fā)育的影響。

毒死蜱；氰戊菊酯；阿維菌素；花翅搖蚊；風(fēng)險(xiǎn)評估；N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；ELISA

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetyl-D-glucosaminidase, NAGase)與幾丁質(zhì)內(nèi)切酶(Endochitinase)、幾丁質(zhì)外切酶(Exochitinase)共同構(gòu)成幾丁質(zhì)代謝酶系，參與幾丁質(zhì)的代謝并將幾丁質(zhì)最后降解為氨基葡萄糖[1]。在節(jié)肢動物中，幾丁質(zhì)酶主要存在于表皮層中的上表皮以及消化道的圍食膜基質(zhì)中，參與食物消化及生理周期性蛻皮等。水生節(jié)肢動物在其生長發(fā)育及繁殖過程中需經(jīng)歷多次脫皮，在此過程中，它們會將脫皮液中的NAGase釋放到水中。動物數(shù)量越多，個體越大，被釋放到水中的酶的量越多。因此，在實(shí)驗(yàn)室和野外考察中，水中NAGase活力的大小可以作為水生節(jié)肢動物的生物量指示因子[2-4]。然而除了節(jié)肢動物，NAGase廣泛存在于真菌、植物等不同類型的生物當(dāng)中，在測定NAGase活力時，由于其反應(yīng)底物不具有特異性，測定結(jié)果難免受到其他生物來源的NAGase的干擾。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，來自不同生物NAGase，其動力學(xué)特征并不相同，分子量和分子結(jié)構(gòu)也不相同[5-7]，據(jù)此，以基于抗原抗體反應(yīng)的免疫化學(xué)方法[8]來測定NAGase，想必可以增強(qiáng)該酶作為生物量指示因子的特異性，從而更加有效地監(jiān)測評估外來化學(xué)品對水生節(jié)肢動物特定種群的影響。

搖蚊屬于節(jié)肢動物門昆蟲綱雙翅目，是淡水池塘中的優(yōu)勢種，在水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[9-10]。作為農(nóng)業(yè)害蟲的近親，它們易受農(nóng)藥，特別是殺蟲劑的脅迫，是水體食物鏈中的“敏感環(huán)節(jié)”[11]。正因?yàn)槿绱耍瑩u蚊常被用來作為底泥污染的指示生物。然而有關(guān)農(nóng)藥等有毒化學(xué)品對于搖蚊影響的生態(tài)毒理學(xué)資料長期以來卻十分欠缺。究其原因，作為底棲生物，人們或許可以檢測到毒物影響搖蚊的最終結(jié)果(如羽化率的降低)，但是很難對影響過程(如對發(fā)育進(jìn)程的影響)進(jìn)行監(jiān)測。本項(xiàng)研究從花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼體中提取NAGase，純化后制備多克隆抗體，然后采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測暴露于毒死蜱、氰戊菊酯、阿維菌素的幼蟲釋放到培養(yǎng)液中的NAGase的免疫含量(NAGase-IR)隨種群生長發(fā)育而發(fā)生的變化。之所以選用上述三種殺蟲劑，一方面基于它們在農(nóng)業(yè)害蟲防治中十分常見，同時也是因?yàn)樗鼈儗u蚊、大型溞等水生節(jié)肢動物毒性較高[12-16]。希望本項(xiàng)研究的結(jié)果能夠?yàn)閾u蚊NAGase多克隆抗體在水生生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試生物

花翅搖蚊Chironomus kiiensis、隆線溞Daphnia carinata、老年低額溞Simocephalus vetulus、多刺裸腹溞Moina macrocopa、中華薄殼介Dolerocypris sinensis均采自浙江大學(xué)華家池，經(jīng)過分離純化后連續(xù)培養(yǎng)一年以上，物種由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境和資源生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定；白紋伊蚊Aedes albopictus由浙江大學(xué)昆蟲所提供；日本沼蝦Macrobrachium nipponense購自杭州南肖埠水產(chǎn)市場；小球藻(Chlorella vulgaris)購自中國科學(xué)院淡水藻種庫。

1.2 供試藥劑

97%毒死蜱原藥、98%氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品和98.3%阿維菌素原藥分別購自“浙江新農(nóng)化工有限公司”、德國“Dr. Ehrenstorfer公司”和“南通泰禾化工有限公司”；Sephadex G-150和DEAE Sephadex A-25購自上海源葉生物科技公司；丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、氨基-2-脫氧-β-D吡喃葡糖苷(4-MUF-NAG)、4-甲基傘形酮(4-MUF)為Sigma產(chǎn)品；羊抗兔IgG-HRP為杭州華安科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器

“GEMIN XPS FluorescenceMicroplateReader”、“VERSA MAXMicroplateReader”購自“Molecular Devices Corporation”；“DNX-9620電腦洗板機(jī)”購自“北京普朗新技術(shù)有限公司”；“DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀”購自“北京六一儀器廠”；“UV-1800紫外可見分光光度計(jì)”購自“上海欣茂儀器有限公司”；“HL-2型恒流泵”、“DBS-100電腦全自動部分收集器”購自“上海滬西分析儀器廠”。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酶的分離純化

參照黃小紅等[17]的方法，以花翅搖蚊幼蟲為材料，按照1:2(W/V)比例加入預(yù)冷的50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.2)緩沖液，冰浴勻漿3～5 min。然后在4℃、10 000 r·min-1下離心30 min，棄去上層沉淀，上清液即為粗酶液。然后采用硫酸銨分級分離，收集60%～80%飽和度的沉淀蛋白，經(jīng)DEAE Sephadex A-25離子交換柱層析后再經(jīng)Sephadex G-150凝膠過濾柱層析，測定各管總蛋白含量[18]和酶活性[19]，合并酶活性高的管，經(jīng)透析、濃縮之后采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板狀凝膠電泳[20]鑒定酶蛋白純度。

1.4.2 間接非競爭ELISA方法

(1)抗體的制備：按照免疫學(xué)方法[21]，選用2只健康的新西蘭純種大白兔作為免疫用動物，制得的抗血清經(jīng)過Protein A 柱純化，分裝冷藏備用。

(2)抗血清效價(jià)的測定參照劉洪翠等[22]測定抗血清的方法。以抗血清稀釋倍數(shù)表示其效價(jià)，即 OD450nm約等于1的抗血清稀釋倍數(shù)為抗血清效價(jià)。

(3)抗原抗體最適工作濃度的選擇：運(yùn)用方陣法對抗原抗體的最適工作濃度進(jìn)行選擇：NAGase稀釋濃度分別為0.32、0.64、1.27、2.55、5.09、7.64、10.18、13.57、20.37 μg·mL-1，針對每一濃度設(shè)置不同的抗血清稀釋倍數(shù)(1:2000；1:4000；1:6000；1:8000；1:10000；1:16000；1:20000)，測定OD450值。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線：將標(biāo)準(zhǔn)品(純花翅搖蚊NAGase)稀釋成系列質(zhì)量濃度(0.01、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、10.00、16.00、20.00 μg·mL-1)，抗血清1:10000倍稀釋，用間接非競爭 ELISA 方法測定得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，用分析軟件DPS進(jìn)行漸進(jìn)回歸分析。

1.4.3 NAGase抗血清特異性

包被100 μL蛋白濃度為0.31 mg·mL-1的花翅搖蚊粗酶于96孔酶標(biāo)板。將其他生物來源的粗酶稀釋成NAGase活性與花翅搖蚊相同的濃度，包被于96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL。使每一種粗酶分別與不同稀釋倍數(shù)的兔抗花翅搖蚊NAGase抗血清反應(yīng)，測定OD450值[22]。

1.4.4 三種農(nóng)藥對花翅搖蚊的毒力

設(shè)置5個試驗(yàn)濃度：毒死蜱(1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg·L-1)，氰戊菊酯(0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 μg·L-1)，阿維菌素(0.4、0.8、1.6、3.2、6.0、8.0 μg·L-1)，各設(shè)1個空白對照和1個丙酮對照，每個濃度設(shè)5個重復(fù)。每個燒杯含200 mL稀釋液，接入40頭體型健壯、大小一致的搖蚊1齡幼蟲，試驗(yàn)期間以螺旋藻粉作為餌料。試驗(yàn)開始后第12天，對照組幼蟲都變?yōu)?齡，此時停止試驗(yàn)并記錄各濃度組搖蚊幼蟲存活數(shù)，由此計(jì)算出三種農(nóng)藥的LC50。

1.4.5 三種農(nóng)藥對水中NAGase釋放量的影響

設(shè)置5個試驗(yàn)濃度：毒死蜱(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg·L-1)，氰戊菊酯(0.002、0.004、0.008、0.016、0.032 μg·L-1)，阿維菌素(0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg·L-1)，各設(shè)1個空白對照和1個丙酮對照，每個濃度設(shè)5個重復(fù)。分別在試驗(yàn)開始后的第2、5、8、10、12 天采集培養(yǎng)液2 mL，過0.22 μm濾膜[23]，分別測定濾液中的NAGase免疫含量(NAGase-IR)[22]和NAGase活力[19]，根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算出三種農(nóng)藥的EC50。

1.4.6 NAGase活力的測定

參照Mark and Laurent[19]的方法。以4-MUF-NAG為底物，在360 nm激發(fā)波長，450 nm發(fā)射波長下測定其發(fā)光值。酶活力的定義：在上述條件下，每分鐘催化底物水解產(chǎn)生1 μmol MUF的酶量，即NAGase的1個活性單位。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析或建立“劑量-反應(yīng)”方程。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 酶的分離與純化

由表1和圖1、圖2可知，經(jīng)硫酸銨鹽析，DEAE Sephadex A-25 陰離子交換柱和Sephadex G-150 分子篩柱純化后，酶的比活力達(dá)到8.06 U·mg-1，純化倍數(shù)為33，所得的NAGase純度達(dá)到電泳純。

2.2 間接非競爭性ELISA

2.2.1 最適抗原抗體工作濃度

根據(jù)定義，當(dāng)陽性孔的OD450值約為1.0陰性對照孔OD450值小于0.1時，抗原抗體達(dá)到最適工作濃度[24]。由表2可知，抗原濃度為7.64 μg·mL-1抗體濃度為1:10000時，陽性孔OD450值最接近1，所以7.64μg·mL-1和1:10000被認(rèn)為分別是抗原和抗體的最適工作濃度。

表1 花翅搖蚊NAGase的純化效果

圖1 純酶的PAGE電泳圖Fig. 1 PAGE of NAGase

圖2 純酶SDS-PAGE電泳圖(A:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；B：純化后的酶)Fig. 2 SDS-PAGE of NAGase(A: Markers; B: Enzyme after purification)

表2 方陣法確定間接非競爭ELISA法最適抗原抗體濃度結(jié)果(OD450)

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3為抗體在1:10000稀釋倍數(shù)下，抗原測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為：Y=a+b (ecx)，其中a=1.0991，b=-1.0208，c=-0.275811，相關(guān)系數(shù)r2=0.9986，標(biāo)準(zhǔn)誤差S=0.013。

2.3 花翅搖蚊NAGase抗體的特異性

表3顯示水中常見的一些節(jié)肢動物和綠藻NAGase活力測定結(jié)果。由表3可知，NAGase在所測生物中均具有分布，比活力大小為：日本沼蝦>隆線溞>花翅搖蚊>多刺裸腹溞>老年低額溞>白紋伊蚊>中華薄殼介>小球藻。

圖3 間接非競爭ELISA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve for indirect and non-competitive ELISA

由表4可知，在保持粗酶樣品中NAGase活力基本一致的條件下，花翅搖蚊NAGase抗體與隆線溞、老年低額溞、多刺裸腹溞、中華薄殼介、日本沼蝦、白紋伊蚊、小球藻NAGase的交叉反應(yīng)率分別為4.41%、3.12%、3.40%、4.23%、3.23%、7.50%和<0.5%。

2.4 農(nóng)藥對花翅搖蚊幼蟲的毒力

毒死蜱、氰戊菊酯和阿維菌素對花翅搖蚊幼蟲的毒力測定結(jié)果如表5所示。由表5可知毒死蜱、氰戊菊酯和阿維菌素的12 d-LC50分別為4.8171(2.731～5.537)、0.0954(0.075～0.121)和2.1340(1.650～2.730)μg·L-1，可見3種殺蟲劑對花翅搖均具有較高的毒力。由于三種藥劑LC50的95%置信區(qū)間沒有重疊，所以對花翅搖蚊12 d毒力：氰戊菊酯>阿維菌素>毒死蜱，且差異顯著。

表3 不同水生生物的NAGase活性比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同列數(shù)據(jù)，以不同英文字母標(biāo)注的，表示處理之間差異顯著(p<0.05)。

Note: Data in the table is mean ±SE and the data marked by different letters in the same column indicate significant difference between treatments (p<0.05).

表4 花翅搖蚊NAGase抗血清的特異性

注：定義花翅搖蚊NAGase的交叉反應(yīng)率為100%；其他生物體的交叉反應(yīng)率(%)=各種生物體抗血清效價(jià)/花翅搖蚊的抗血清效價(jià)×100%；表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同列數(shù)據(jù)，以不同英文字母標(biāo)注的，表示處理之間差異顯著(p<0.05)。

Note: Defining the cross-reactivity of Chironomus kiiensis is 100%; Other organisms cross reactivity rate(%)=the titer of antiserum from various organisms/the titer of antiserum from Chironomus kiiensis×100%;data in the table is mean ±SE and the data marked by different letters in the same column indicate significant difference between treatments (p<0.05).

2.5 農(nóng)藥對水中NAGase-IR釋放量的影響

毒死蜱、氰戊菊酯和阿維菌素對花翅搖蚊幼蟲NAGase-IR水中釋放量的影響如表6所示。從表6中可以看出三種殺蟲劑對NAGase-IR的12 d-EC50分別為1.2012、0.0043、0.6281 μg·L-1。因此，花翅搖蚊在三種農(nóng)藥作用下，其釋放到水中的NAGase-IR受到了影響，且受試藥劑的濃度與其NAGase-IR釋放量存在相關(guān)關(guān)系。

表5 三種農(nóng)藥對花翅搖蚊幼蟲毒力

表6 三種農(nóng)藥對花翅搖蚊NAGase-IR的抑制作用

表7 三種農(nóng)藥對花翅搖蚊NAGase活力的抑制作用

表8 不同農(nóng)藥對NAGase-IR的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同行數(shù)據(jù)，以不同英文字母標(biāo)注的，表示處理之間差異顯著(p<0.05)。Note: data in the table is mean ±SE and the data marked by different letters in the same line indicate significant difference between treatments (p<0.05).

表9 不同農(nóng)藥對NAGase活力的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同行數(shù)據(jù)，以不同英文字母標(biāo)注的，表示處理之間差異顯著(p<0.05)。Note: Data in the table is mean ±SE and the data marked by different letters in the same line indicate significant difference between treatments (p<0.05).

表8顯示了在毒死蜱、氰戊菊酯和阿維菌素作用下，花翅搖蚊幼蟲釋放到水中的NAGase-IR的含量隨時間的變化。由表8可以看出，在同一藥劑濃度下，水中NAGase-IR的含量隨時間增長不斷增大，且到試驗(yàn)結(jié)束時，水中NAGase-IR濃度均明顯高于試驗(yàn)開始時；另外，對同一種藥劑，隨著其濃度的增大，NAGase-IR濃度的變化量反而減少，與對照相比，藥劑濃度越高，NAGase-IR濃度出現(xiàn)明顯增大所需要的時間越長。

2.6 農(nóng)藥對水中NAGase活力的影響

毒死蜱、氰戊菊酯和阿維菌素對花翅搖蚊幼蟲培養(yǎng)液中NAGase活力的影響如表7所示。從表7中可以看出，三種農(nóng)藥對NAGase活力12 d-EC50分別為1.4765、0.0051、0.6756 μg·L-1。

在毒死蜱、氰戊菊酯和阿維菌素作用下，花翅搖蚊幼蟲釋放到水中的NAGase的活力隨時間的變化如表9所示。由表9可以看出，在同一藥劑濃度下，隨著時間的增長，NAGase活力出現(xiàn)上升、下降再上升的變化趨勢；同時，對于同一藥劑，隨著藥劑濃度的增大，NAGase活力變化量卻隨之減少，與對照相比，在較高的濃度組，NAGase活力則幾乎沒有出現(xiàn)明顯的增長。

3 討論(Discussion)

為制備NAGase的多克隆抗體,本試驗(yàn)從花翅搖蚊Chironomus kiiensis幼蟲體內(nèi)分離得到電泳純的NAGase，測得其亞基分子量約為13 KD，這是首次關(guān)于搖蚊科NAGase亞基分子量的報(bào)道。Angulo[25]和Filho[26]曾研究過與搖蚊同屬為雙翅目的羊膚蠅Oestrus ovis和埃及伊蚊Aedes aegypti NAGase亞基的分子量，前者在20～63 KD之間，后者分別為33KD和40KD，兩者均高于花翅搖蚊，可見即使在雙翅目昆蟲內(nèi)部，NAGase在結(jié)構(gòu)上也存在某種程度的差異。

在本項(xiàng)研究中制備花翅搖蚊NAGase多克隆抗體的目的在于尋找一種針對搖蚊的生物量的相對特異性的檢測方法，既方便對花翅搖蚊種群發(fā)育進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，又克服了用NAGase活力作為檢測指標(biāo)時，其結(jié)果可能會受到的其他生物來源的NAGase的干擾。特異性研究的結(jié)果顯示，花翅搖蚊NAGase多克隆抗體與包括枝角類、中華薄殼介、蝦在內(nèi)的甲殼動物的NAGase的交叉反應(yīng)率很低，僅在3.12%～4.17%之間，它與小球藻的交叉反應(yīng)率更是低于0.5%(表4)，這說明在生物量檢測中，該抗體不僅能將搖蚊與甲殼動物分開，受到綠藻干擾的可能性也很小。在昆蟲綱內(nèi)部，搖蚊NAGase抗體與同屬雙翅目的伊蚊的交叉反應(yīng)率只有7.50%。這說明花翅搖蚊的抗體有可能將昆蟲綱的某些動物剔除。

當(dāng)水生節(jié)肢動物的數(shù)量及生長受到外界因素影響時，其釋放到水中的NAGase含量也會發(fā)生改變[27-29]。在三種農(nóng)藥的作用下，花翅搖蚊生長受到抑制，其NAGase的水中釋放量也相應(yīng)減少。本試驗(yàn)運(yùn)用抗體測得毒死蜱、氰戊菊酯和阿維菌素三種殺蟲劑對于NAGase-IR的12 d-EC50分別為1.2012 (0.873～1.653)、0.004(0.004～0.005)和0.628(0.481～0.820) μg·L-1(表6)；以酶活力測試三種農(nóng)藥相應(yīng)的EC50分別為1.477(1.160～1.870)、0.005(0.004～0.007)和0.676(0.424～1.076) μg·L-1(表7)。以死亡作為測試終點(diǎn)的12 d-LC50分別為4.8171 (2.731～5.537)、0.0954 (0.075～0.121)和2.1340 (1.650～2.730) μg·L-1(表5)。由3種方法的EC50、LC50及其95%置信區(qū)間可知，用NAGase-IR變化來表示三種農(nóng)藥對花翅搖蚊的影響，其EC50值略低于用NAGase活力表示的EC50，但差異并不顯著；而這兩種方法所得到的EC50均顯著低于用死亡率表示的LC50?？梢娪肗AGase-IR及活力的變化來表示農(nóng)藥對花翅搖蚊影響時比用死亡率更加靈敏。在農(nóng)藥作用下，NAGase-IR及其活力發(fā)生變化可能是因?yàn)檗r(nóng)藥抑制了花翅搖蚊的生長發(fā)育，使其蛻皮時產(chǎn)生的NAGase量受到影響[30]；也可能是因?yàn)檗r(nóng)藥的作用，使花翅搖蚊的生物量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致產(chǎn)生的NAGase受到影響。

由表9中可以看出，在試驗(yàn)的某些時段，水中NAGase的活力不但不上升，反而有所下降。其可能的原因是，在這些時段，搖蚊處于兩次脫皮之間的生長期，其向水中釋放NAGase的量減少，與此同時，已經(jīng)釋放的酶在不斷降解，直至下一次蛻皮時有新的酶釋放出來。然而在相應(yīng)時段，NAGase-IR含量的絕對值并未出現(xiàn)明顯下降(表8)。這說明即使NAGase的催化活性因酶的降解而喪失，作為抗原，NAGase-IR仍然可以被抗體檢測到。從抗原和酶的角度進(jìn)行比較，前者的穩(wěn)定性和持久性一般優(yōu)于后者[31]?？梢奛AGase-IR比NAGase活力本身更適合于測量生物量在一段時間以來的積累情況。

從靈敏度的角度比較利用NAGase活力和NAGase-IR作為檢測指標(biāo)的兩種方法，由表8和表9可知，NAGase-IR濃度在第5天出現(xiàn)明顯上升，相比之下，NAGase活力開始出現(xiàn)明顯上升的轉(zhuǎn)折點(diǎn)最早在第8天；另外，在最大藥劑濃度時，NAGase-IR濃度在第12天時明顯高于第2天的，但是并沒有檢測到NAGase活力出現(xiàn)明顯上升，這進(jìn)一步反映出NAGase-IR相較于NAGase活力要更加靈敏。

致謝：感謝南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院環(huán)境和資源生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室王新華老師在水生生物鑒定上的幫助和支持。

[1] Davis B, Eveleigh D E. Chitin, Chitin Chitosan and Related Enzymes [M]. Oriando:Academic Press, 1984: 61-179

[2] Conley J M, Schorr M S, Hanson M L, et al. Is ambient chitobiase activity a monitoring tool for impacts on secondary production in loticsystems[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2009, 66: 1274-1281

[3] Hanson M, Lagadic L. Chitobiase activity as an indicator of aquatic ecosystem health[J]. Health Manage, 2005, 8: 441-450

[4] Richards S M, Kelly S E, Hanson M L. Zooplankton chitobiase activity as an endpoint of pharmaceutical effect [J]. Archives of Environment Contamination and Toxicology, 2008, 54: 637-644

[5] Vrba J. Comment to Sherr and Sherr (1999): Is there any appropriate way to distinguish different β-N-acetylhexosaminidase activities in aquatic environments [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2000, 33: 81-84

[6] Vrba J, Callieri C, Bittl T, et al. Are bacteria the major producers of extracellular glycolytic enzymes in aquaticenvironments [J]. International Review of Hydrobiology, 2004, 89(1): 102-117

[7] Vrba J, Kofroňová-Bobková J, Pernthaler J, et al. Extracellular low-affinity (β-N-acetylglucosaminidases) linked to the dynamics of Diatoms and Crustaceans in freshwater systems of different trophic degree [J]. International Review of Hydrobiology, 1997, 82(2): 277-286

[8] Gerrit P, Reinhard S, Rolf M, et al. Isoforms of an N-acetyl-β-D-glucosaminidase from the Antarctickrill, Euphausia superba: Purification and antibody production[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 1998, 120: 743-751

[9] Shang J G, Zhang L, Shi C J, et al. Influence of chironomid larvae on oxygen and nitrogen fluxes across the sediment-water interface (Lake Taihu, China)[J]. Journal of Environmental Sciences, 2013, 25(5): 978-985

[10] Jiang P H, Ji L, Xiao W J, et al. Bioturbation of two chironomid species on nutrient exchange at sediment-water interface in a Chinese shallow eutrophic lake[J]. Fresenius Environmental Bulletin, 2010, 19(5a): 902-910

[11] 王印, 王軍軍, 秦寧, 等. 應(yīng)用物種敏感性分布評估DDT和林丹對淡水生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 29(11): 2407-2414

[12] 張雪梅, 王成菊. 農(nóng)藥對大型蚤的毒作用研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2007, 28(12): 53-57

[13] 張曉群, 張大弟, 徐正泰. 氰戊菊酯在池塘生態(tài)系統(tǒng)中的消解[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1992, 8(4): 77-82

[14] 葛士林, 曹傳旺, 王志英. 3種農(nóng)藥對紅裸須搖蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和AChE活性的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 39(1): 108-109

[15] 趙燕, 湯保華，蔡磊明，等. 殺菌劑戊唑醇對花翅搖蚊(Chironomus kiiensis)幼蟲的急性毒性和抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J]. 農(nóng)藥, 2012, 51(6): 445-448

[16] 程燕, 周軍英, 單正軍, 等. 國內(nèi)外農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)研究綜述[J]. 農(nóng)村生態(tài)環(huán)境, 2005, 21(3): 62-66

[17] 黃小紅, 王壽昆, 黃一帆, 等. 日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步純化及部分性質(zhì)[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2006, 12(6): 804-808

[18] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of microgram quantities of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254

[19] Mark L H, Laurent L. Chitobiase activity as an indicator of aquatic ecosystem health[J]. Aquatic Ecosystem Health and Management, 2005, 8(4): 441-450

[20] 李建武, 蕭能庚, 余瑞元, 等. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 1997

[21] 余平. 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 武漢: 華中科技大學(xué)出版社, 2012: 8

[22] 劉洪翠, 楊艷霞, 李少南. 大型溞膽堿酯酶間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附定量分析法的建立[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2012, 38(3): 347-354

[23] Oosterhuis S S, Baars M A, Klein C M. Release of the enzyme chitobiase by the copepod Temoralongicornis: Characteristics and potential tool for estimating crustacean biomass production in the sea[J]. Marine Ecology-Progress Series, 2000, 196: 195-206

[24] 楊利國, 胡少昶, 魏平華, 等. 酶免疫測定技術(shù)[M]. 南京: 南京大學(xué)出版社, 1998: 385-481

[25] Angulo-Valadez C E, Cepeda-Palacios R, Ascencio F, et al. Proteolytic activity in salivary gland products of sheep bot fly (Oestrus ovis) larvae[J]. Veterinary Parasitology, 2007, 149(1/2):117-125

[26] Filho Benedito P D, Lemos Francisco J A, Secundino Nágila F C, et al. Presence of chitinase and beta-N-acetylglucosaminidase in the Aedes aegypti: A Achitinolytic system involving peritrophic matrix formation and degradation[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32(12): 1723-1729

[27] Akash R, John C. Rate of chitobiase degradation as a measure of development rate in planktonic Crustacea[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2000, 57: 1965-1968

[28] Avila T R, Machado A A de S, Bianchini A. Estimation of zooplankton secondary production in estuarine waters: Comparison between the enzymatic (chitobiase) method and mathematical models using crustaceans[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2012, 416-417: 144-152

[29] Sastri A R, Dower J F. Field validation of an instantaneous estimate of in situ development and growth for marine copepod communities [J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2006, 63: 2639-2647

[30] 林建成. 節(jié)肢動物幾丁質(zhì)酶及其在蛻皮中的生理作用[J]. 德州學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 21(6): 45-49

[31] 楊艷霞. 大型溞ChE免疫測定：有機(jī)磷殺蟲劑的生物指示[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2010

◆

Assessing the Impact of Pesticides on Population Development ofChironomuskiiensisBased on Content of β-N-Acetyl-D-glucosaminidase

Zhou Surui, Zhang Wenping, Li Shaonan,*Zhu Guonian

Institute of Pesticide and Environmental Toxicology, Zhejiang University, Hangzhou 310029

15 May 2014 accepted 3 June 2014

Risk assessment on population level is still challenged by its proper in terms of methodology. In this work, population development of Chironomus kiiensis was assessed by quantity of β-N-Acetyl-D-glucosaminidase (NAGase) released from the larvae. To do so, the NAGase was purified from the bodies and polyclonal antibodies were obtained by immunizing rabbits with the purified enzyme. Indirect and non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was employed to analyze specificity of the antibodies, and the results showed that the cross reactions was 4.41% for Daphnia carinata, 3.12% for Simocephalus vetulus, 3.40% for Moina macrocopa, 4.17% for Dolerocypris sinensis, 3.23% for Macrobrachium nipponense, 7.50% for Aedes albopictus, and <0.5% for Chlorella vulgaris. After being exposed for 12 days to pesticides, the EC50based on residues of NAGase, which was determined by ELISA, was 1.201 μg·L-1for chlorpyrifos, 0.004 μg·L-1for fenvalerate, and 0.628 μg·L-1for abamectin. The EC50determined by activity of NAGase was 1.477 μg·L-1for chlorpyrifos, 0.005 μg·L-1for fenvalerate, and 0.676 μg·L-1for abamectin. However, the LC50were measured to be 4.817 μg·L-1for chlorpyrifos, 0.095 μg·L-1for fenvalerate, and 2.134 μg·L-1for abamectin. Our results suggested that the impact of pesticides on population development of Chironomus kiiensis could be assessed distinctively by quantity of NAGase released by the larvae.

chlorpyrifos; fenvalerate; abamectin; Chironomus kiiensis; risk assessment; β-N-acetyl-D-glucosaminidase; ELISA

浙江省自然科學(xué)基金 ( LY12B07008)

周素銳(1987-)，女，碩士，研究方向?yàn)樗鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail： 21116108@zju.edu.cn；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: snli@zju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140515001

2014-05-15 錄用日期：2014-06-03

1673-5897(2015)1-288-09

X171.5

A

李少南(1963—)，男，副教授，主要研究方向?yàn)樗鷳B(tài)毒理學(xué)。

周素銳，張文萍，李少南，等. 利用N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶含量評價(jià)農(nóng)藥對花翅搖蚊種群發(fā)育的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(1): 288-296

Zhou S R, Zhang W P, Li S N, et al.Assessing the impact of pesticides on population development of Chironomus kiiensisbased on content of β-N-acetyl-D-glucosaminidase[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(1): 288-296 (in Chinese)