李克梅, 董艷秋, 曹雪松, 巴依爾

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

新疆設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲病發(fā)生調(diào)查及病原鑒定

李克梅#*, 董艷秋#, 曹雪松, 巴依爾

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

對新疆蔬菜根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)蔬菜根結(jié)線蟲在和田、阿克蘇、庫爾勒、吐魯番、伊犁等南北疆設(shè)施蔬菜上均有分布和發(fā)生危害,露地蔬菜尚未見發(fā)生。從各發(fā)生地溫室中采集14份蔬菜根結(jié)線蟲樣本,寄主主要是番茄,另外還有豇豆、黃瓜、生菜、香芹、苦瓜。采用形態(tài)學(xué)以及根結(jié)線蟲特異性引物PCR相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明新疆設(shè)施蔬菜上有南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)和北方根結(jié)線蟲(M.hapla)兩種,優(yōu)勢種群為南方根結(jié)線蟲。

根結(jié)線蟲; 形態(tài)學(xué)觀察; 分子鑒定

根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是世界上危害最嚴(yán)重的植物病原線蟲之一,也是一類在蔬菜作物上危害極大的線蟲,其寄主范圍廣泛,種類多,分布廣,幾乎能侵染所有蔬菜作物[1]。新疆地處中國西北邊陲,由于冬季氣候寒冷,并不適于根結(jié)線蟲的生存越冬。但是隨著新疆設(shè)施農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展及農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整,設(shè)施栽培的高復(fù)種指數(shù)和長期單一化的栽培為蔬菜根結(jié)線蟲的發(fā)生、發(fā)展提供了適宜的生長環(huán)境,土壤中的根結(jié)線蟲得以積聚增殖[2]。蔬菜根結(jié)線蟲逐漸成為當(dāng)前新疆設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中的一大障礙。1991年全俊仁等[3]在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所首次發(fā)現(xiàn)辣椒根結(jié)線蟲,經(jīng)鑒定為北方根結(jié)線蟲(Meloidogyne hapla)。2009年杜蘭英等[4]在新疆哈密發(fā)現(xiàn)黃瓜根結(jié)線蟲病的發(fā)生。據(jù)調(diào)查目前根結(jié)線蟲病已經(jīng)在新疆多地設(shè)施蔬菜發(fā)生嚴(yán)重,特別是在阿克蘇、吐魯番、伊犁、輪臺(tái)、庫爾勒等南北疆設(shè)施蔬菜發(fā)生危害嚴(yán)重。但是對其病原種類及其分布尚不明確。目前關(guān)于該病害的防治主要采取化學(xué)手段,而使用化學(xué)藥劑對蔬菜生產(chǎn)安全造成極大隱患,更會(huì)對人體和環(huán)境造成危害[5],因此根結(jié)線蟲病的綠色防治迫在眉睫。

鑒于不同種根結(jié)線蟲之間有顯著的致病性差異[6],因而準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲的種類是防治根結(jié)線蟲病的基礎(chǔ)。本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)描述以及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定了新疆不同地區(qū)設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲的種類,為進(jìn)一步開展新疆設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2013年9月-2014年5月從新疆7個(gè)不同縣、市設(shè)施蔬菜大棚中采集14份蔬菜病株及病土材料(見表2),帶回實(shí)驗(yàn)室置于4℃冰箱備用;從每份病根樣品中挑取20個(gè)單卵囊分別接種于預(yù)先培植在滅菌沙培馬鈴薯根部,置人工氣候箱25℃培養(yǎng),建立純化種群。

1.2 試劑和儀器

試驗(yàn)所用試劑、酶類等均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照劉維志[1]的方法。將收集到的2齡幼蟲、雄蟲熱殺死后用FG固定液固定,制備臨時(shí)玻片鏡檢觀察,描述形態(tài)。雌蟲會(huì)陰花紋玻片的制作參照馮志新等[7]的方法,鏡檢觀察會(huì)陰花紋特征并照相。

1.4 根結(jié)線蟲的DNA提取

參照王江嶺等、沈錫權(quán)等[8-9]提取單條根結(jié)線蟲DNA的方法并稍作改進(jìn)。大量根結(jié)線蟲DNA的提取參照孫龍華等[10]所介紹的方法并稍作修改。

1.5 特異性引物PCR鑒定方法

選用Meng等[11]報(bào)道的根結(jié)線蟲特異性擴(kuò)增引物MI-F/MI-R、MJ-F/MJ-R,馮光泉等[12]報(bào)道的Mh-F/Mh-R分別進(jìn)行特異性擴(kuò)增(引物序列見表1)。采用25μL反應(yīng)體系：2μL 10×PCR Buffer (Mg2+);2μL d NTPs(2.5 mmol/L);引物各0.5μL (10μmol/L);0.2μL(5U)Taq酶;DNA懸浮液2μL, dd H2O補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增條件為：94℃5 min,94℃30 s,退火溫度(61℃或55℃)45 s,72℃2 min,30個(gè)循環(huán),72℃8 min,4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測,在紫外照膠儀上觀察并照相。

表1 根結(jié)線蟲分子鑒定所用引物Table 1 PCR primers used for molecular identification of root knot nematodes

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

感染根結(jié)線蟲病輕病株癥狀不明顯,重病株生長不良,植株矮小,結(jié)實(shí)小且少,嚴(yán)重時(shí)整株葉片黃化甚至萎蔫枯死。根部產(chǎn)生多個(gè)根結(jié),有時(shí)膨大成團(tuán)狀。卵囊初期呈黃白色,后呈黃褐色至黑褐色。解剖根結(jié)可見其中有針尖大小的乳白色近透明的梨形雌蟲。

2.2 病原根結(jié)線蟲形態(tài)鑒定

對采自新疆各地的根結(jié)線蟲進(jìn)行形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)有2個(gè)不同類群。

類型1：

2齡幼蟲：頭冠清楚,有不太明顯的環(huán)紋,口針較細(xì),椎體與基桿的界限明顯,口針基部球小且向后漸圓,中食道球橢圓形,瓣門明顯,大多數(shù)直腸膨大,尾透明,末端界限大多明顯,通常不平滑,稍有縊縮,尾尖鈍圓或尖圓。

雄蟲：體比較長,頭冠明顯凹陷,頭區(qū)有不完全環(huán)紋,但是不明顯?？卺樺F頂端鈍,口針基部球橫向擴(kuò)展,與基桿界限分明,尾端細(xì)圓。

類型2：

2齡幼蟲：頭冠窄小,頭區(qū)無環(huán)紋,口針細(xì)小,基部球圓,多數(shù)直腸不膨大。尾端較粗,尾透明末端界限明顯。

雄蟲：體比較短小,有的小于1 000μm,頭冠比頭區(qū)小,頭部與體部界限分明?？卺樧刁w部窄,向后漸粗,口針基部球圓形,與基桿分界分明,尾端鈍圓。

參考劉維志主編的《植物病原線蟲學(xué)》[1]、《植物線蟲志》[13],認(rèn)為類型1與南方根結(jié)線蟲相類似,類型2與北方根結(jié)線蟲相似。

對采自新疆7個(gè)地區(qū)的14個(gè)根結(jié)線蟲樣本會(huì)陰花紋進(jìn)行觀察,主要發(fā)現(xiàn)2種會(huì)陰花紋表型(圖1)。一種主要特征是：整體卵圓形,線紋平滑或有時(shí)呈“Z”形,背弓較高,呈方形,側(cè)線交叉成刻痕,有些不明顯。另一種會(huì)陰花紋主要特征為：背弓通常呈圓形,線紋較平滑,側(cè)線不明顯,尾端處有明顯刻點(diǎn)。分別與劉維志[1]描述的南方根結(jié)線蟲(M.incognita)和北方根結(jié)線蟲(M.hapla)會(huì)陰花紋相似。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

分別對采自新疆不同地區(qū)溫室中寄主為番茄樣品的根結(jié)線蟲混合群體進(jìn)行特異性引物PCR檢測,其中以MJ-F/MJ-R為引物未擴(kuò)增出任何特異性條帶,而引物MI-F/MI-R和引物Mh-F/Mh-R則在不同樣品中均得到與預(yù)期大小相同的片段,說明新疆設(shè)施蔬菜上存在M.incognita和M.hapla 2種根結(jié)線蟲(圖2)。

圖1 兩種根結(jié)線蟲雌蟲會(huì)陰花紋形態(tài)圖Fig.1 Morphology of two kinds of root knot nematode female perineal pattern

圖2 新疆不同地區(qū)部分番茄土樣中采集的根結(jié)線蟲經(jīng)特異性引物擴(kuò)增的電泳圖譜Fig.2 PCR amplification with root-knot nematode DNA from tomato soil sampled in different areas of Xinjiang by specific primers

分別對新疆14個(gè)樣品中單卵囊接種培育的根結(jié)線蟲DNA進(jìn)行特異性引物PCR檢測,以伊犁地區(qū)樣品為例(圖3),用單卵囊接種培育的20個(gè)純種群分別提取總DNA,經(jīng)過特異性引物檢測后計(jì)算出2個(gè)種的比例。

圖3 新疆XJ-4種群純化根結(jié)線蟲DNA經(jīng)特異性引物擴(kuò)增的電泳圖譜Fig.3 PCR amplification with root-knot nematode DNA of XJ-4 by specific primers

特異性引物MI-F/MI-R擴(kuò)增片段約為950 bp左右,與南方根結(jié)線蟲大小一致,特異性引物Mh-F/Mh-R對供試線蟲PCR擴(kuò)增片段約460 bp,與北方根結(jié)線蟲大小一致。由圖3可知伊犁地區(qū)設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲群體中有南方根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲,比例為17∶3。

根據(jù)對根結(jié)線蟲的形態(tài)和會(huì)陰花紋的觀察,結(jié)合特異性引物檢測,結(jié)果表明新疆有南方根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲2個(gè)種。其中14份樣品中有9份樣品是包含南方和北方根結(jié)線蟲2個(gè)種的混合種群,南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢種群,另外5份樣品僅包含南方根結(jié)線蟲1個(gè)種(表2)。

表2 不同來源設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲樣本鑒定結(jié)果Table 2 Identification of greenhouse vegetable root knot nematodes from different samples

3 結(jié)論與討論

世界上已報(bào)道的根結(jié)線蟲種類有90多種,中國已報(bào)道的有56種[14],其中南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲是地理分布和寄主范圍最廣、最常見的種類[15],在37°N以北地區(qū)最常見是北方根結(jié)線蟲[16]。據(jù)報(bào)道,由根結(jié)線蟲引起的農(nóng)作物損失中90%以上由上述4個(gè)最常見種引起[6]。我國王仁剛等[17]報(bào)道的北京市蔬菜病原根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲,柳永娥等[18]報(bào)道的甘肅省白銀市蔬菜病原根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲,其中南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢種群。本研究通過線蟲形態(tài)學(xué)結(jié)合根結(jié)線蟲不同種的特異性引物擴(kuò)增片段鑒定出新疆不同地區(qū)的14個(gè)樣品中既有南方根結(jié)線蟲也有北方根結(jié)線蟲,根據(jù)對本研究每個(gè)群體提取20份單卵囊純化培養(yǎng)后的大量2齡幼蟲DNA的PCR檢測結(jié)果可知其中優(yōu)勢種群是南方根結(jié)線蟲。

近年來,關(guān)于鑒定根結(jié)線蟲種類的研究報(bào)道有很多,目前最穩(wěn)定的還是分子生物學(xué)鑒定方法。本研究開始采用線蟲ITS通用引物進(jìn)行PCR,并不能完全快速鑒定根結(jié)線蟲種類,因?yàn)榉N與種之間ITS區(qū)差異很小,它只是重要病原線蟲種間水平的強(qiáng)有力的輔助工具,必須結(jié)合形態(tài)學(xué)或其他分子生物學(xué)方法才能準(zhǔn)確地進(jìn)行根結(jié)線蟲的分類[16]。于是本試驗(yàn)進(jìn)行特異性引物PCR,可以依據(jù)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性來鑒定根結(jié)線蟲。這種方法能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定出根結(jié)線蟲的種類,并且不受蟲體發(fā)育以及周圍環(huán)境的影響,而且對于雄蟲和單條2齡幼蟲也同樣適用。本試驗(yàn)結(jié)果也為新疆根結(jié)線蟲種群的綜合防治提供了重要的依據(jù)和基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：王 音)

Occurrence and identification of root-knot nematode on greenhouse vegetables in Xinjiang

Li Kemei, Dong Yanqiu, Cao Xuesong, Bayier

(College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

Occurrence of vegetables root-knot nematode diseases was investigated in Xinjiang.Root-knot nematodes occurred in greenhouse vegetables in Hotan,Aksu,Korla,Turpan,Ili prefecture in South and North of Xinjiang,but didn’t find in open field vegetables.Fourteen samples of root-knot nematode were collected in the greenhouse in seven counties and cities of Xinjiang.We found that host plants are mainly tomato,cowpea,cucumber,lettuce,celery,and bitter melon.Morphology observation and PCR amplification results indicated that of the sampled knot-root nematodes belong to Meloidogyne incognita and M.hapla,respectively,and the dominant population was M.incognita.

Meloidogyne spp.; morphological observation; molecular identification

S 436.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.035

2014-10-02

2015-02-25

新疆維吾爾自治區(qū)教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(XJEDU2012I17);溢達(dá)獎(jiǎng)學(xué)金

*通信作者 E-mail：835004213@qq.com

# 并列第一作者,對本文具同等貢獻(xiàn)。