周麗娟，李桂萍，蔡士兵，巴青松

（1.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；2.安徽濉溪農(nóng)業(yè)科研試驗站，安徽 濉溪 235100 ）

黑糯玉米含有豐富的天然黑色素，其黑色素具有很好的抗氧化、清除自由基、抗突變、抗腫瘤等生理功能，有很高的醫(yī)療保健價值.近年來，隨著人們生活水平和對健康要求的不斷提高，黑糯玉米備受消費者青睞［1-2］.

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，與其相關(guān)的實驗技術(shù)在黑糯玉米優(yōu)良種質(zhì)篩選、遺傳多樣性的研究以及性狀改良等方面發(fā)揮越來越重要的作用，尤其對于黑糯玉米基因資源的挖掘與利用提供新的方法與手段［3-5］.在利用PCR方法對黑糯玉米資源遺傳多樣性進行分析和其他分子生物學(xué)研究時，黑糯玉米基因組DNA的提取方法是決定后續(xù)實驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵.目前，從玉米植物組織材料中提取DNA的方法通常有SDS法、CTAB法、改良CTAB法等多種不同的方法［6-8］.對于黑糯玉米不同部位的組織材料，由于其中所含的次生代謝產(chǎn)物不同，DNA的提取方法也不盡相同.本研究分別以黑糯玉米幼苗、種子和盾片為材料，采用CTAB法、SDS法和堿煮法分別對3種實驗材料進行基因組DNA的提取及DNA質(zhì)量的檢測，以期通過比較分析獲得黑糯玉米理想的DNA提取方案，為進一步開展黑糯玉米的分子生物學(xué)研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

黑糯玉米自交系種子由淮北市濉溪農(nóng)科所提供.在光照培養(yǎng)箱發(fā)苗，取4葉期玉米幼苗的倒二葉用于葉片DNA提??；同時選取大小均勻的種子用于種子DNA提取；另外將種子的盾片用刀片分離下來用于DNA提取.

1.2 實驗方法

本研究用于黑糯玉米不同組織材料基因組DNA提取的方法有CTAB法［9］、SDS法［10］和堿煮法［11］，每種方法對每一種材料重復(fù)提取2次以上.

1.2.1 不同組織材料的處理

取黑糯玉米幼葉0.1 g放入用液氮預(yù)冷的研缽中，倒入足量的液氮迅速研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?；取兩粒用蒸餾水浸泡12 h左右的黑糯玉米種子，剝?nèi)シN皮放入研缽中研磨至很細的粉末狀，后轉(zhuǎn)入離心管中保存?zhèn)溆茫?］；取干種子的盾片20粒放入研缽中研磨至粉末狀后轉(zhuǎn)入離心管中保存?zhèn)溆茫?2］.葉片、種子和盾片分別研磨8管，每種實驗方法所用組織材料的處理均相同.

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測

（1）瓊脂糖凝膠電泳檢測

取5 μL DNA樣品和3 μL 6×loading buffer 混勻，上樣于0.8%瓊脂糖凝膠，100 V電泳約40 min，在凝膠成像儀上觀察和拍照.

（2）紫外分光光度計檢測

取24 μL DNA 樣品用TE 稀釋至2.4 mL 用TE 做空白對照.在紫外分光光度計上測定OD260和OD280的值，重復(fù)4次.

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究所得數(shù)據(jù)均用spss20.0處理分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取不同組織材料DNA形態(tài)比較

2.1.1 CTAB法

取4管裝有磨碎葉片離心管加入與樣品等體積65 ℃預(yù)熱的CTAB 提取液充分混勻后，放入65 ℃恒溫水浴鍋水浴50 min；取出離心管冷卻至室溫后加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），混合搖勻放在搖床上振蕩40 min；抽提完成后于高速冷凍離心機按照8 000 r/min，4 ℃離心15 min；轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，加入約2倍體積-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇，輕搖后即析出白色絮狀DNA沉淀.

從樣品種子和盾片的離心管取出的上清夜在加入二倍體積預(yù)冷的無水乙醇后析出的不是白色絮狀沉淀，而是整管都呈渾濁狀態(tài)，在-20 ℃沉淀30 min后全部沉到管底，但最終沒有抱團現(xiàn)象.

2.1.2 SDS法

用SDS法對3種不同材料提取DNA過程中DNA析出現(xiàn)象與CTAB法比較相似.從葉片提取的DNA呈白色絮狀沉淀，而從種子和盾片提取的DNA不容易抱團，呈松散狀.

2.1.3 堿煮法

取裝有種子和盾片的離心管，分別加入0.2 mol/L NaOH 后沸水浴15 min；待冷卻至室溫，加入0.5 mol/L Tris-HCL和TE8.0；后于高速冷凍離心機按照10 000 r/min，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，4 ℃保存用以后續(xù)檢測.

2.2 DNA樣品凝膠電泳檢測結(jié)果

圖1 不同方法提取的葉片基因組DNA電泳圖

圖2 不同方法提取的種子和盾片DNA電泳圖

對于用黑糯玉米不同組織材料提取的DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測.結(jié)果表明，用種子和盾片提取的DNA質(zhì)量都比較差，電泳后只有微弱的主帶，有些甚至無主帶產(chǎn)生.而用葉片提取的基因組DNA質(zhì)量較好，帶型清晰，亮度均一，DAN片段大小一致，無明顯拖尾現(xiàn)象（見圖1、2）.

對于用不同方法提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測.結(jié)果表明，用種子和盾片提取基因組DNA的方法中，堿煮法的效果最差，幾乎看不出條帶，CTAB法和SDS法效果也很不好，電泳檢測結(jié)果只有很微弱的主帶（圖2），說明要提取黑糯玉米基因組DNA，種子和盾片不是理想的提取材料.在用黑糯玉米苗期葉片提取基因組DNA 的兩種方法中，CTAB 法明顯好于SDS 法（圖1）.用CTAB 法提取的DNA 電泳檢測結(jié)果無明顯拖尾現(xiàn)象，亮度均一，DNA片段大小一致，RNA的污染低，且加樣孔內(nèi)的亮度很低，說明蛋白質(zhì)和酚類的污染很低；而用SDS法提取的DNA電泳檢測結(jié)果有個別主帶有輕微的拖尾現(xiàn)象，且RNA的污染也比CTAB 法明顯，且加樣孔內(nèi)有明顯的亮度，說明DNA 樣品中有明顯的蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染.

2.3 DNA樣品分光光度檢測結(jié)果

分別用CTAB 法、SDS 法和堿煮法提取的黑糯玉米種子和盾片的DNA 樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，沒有提到或者僅僅提到微量的DNA，故不對以上兩種組織材料提取的DNA樣品進行紫外分光光度法檢測.只對用黑糯玉米幼嫩葉片提取的DNA進行紫外分光光度法檢測，結(jié)果見表1，將表1結(jié)果進一步處理得表2.

表1 CTAB法和SDS法提取黑糯玉米葉片基因組DNA的純度

表2 CTAB法和SDS法提取黑糯玉米基因組DNA的純度比較

從表1、表2可以看出，CTAB法提取的葉片DNA樣品的純度OD260/OD280在1.61～1.88之間，DNA樣品純度都較高，其均值為1.782 5，大于SDS法提取DNA的純度均值，且標準誤明顯比SDS的均值標準誤小，穩(wěn)定性較高.而 SDS 法提取的 DNA 樣品的純度 OD260/OD280 在 1.52～1.55 之間，有一管為 2.10，DNA樣品純度都較低，說明可能含有較多的酚類物質(zhì)或者蛋白質(zhì)，有一管含有較多的RNA.由此可以看出CTAB法提取的黑糯玉米葉片基因組DNA樣品純度較高、穩(wěn)定性好，此方法優(yōu)于SDS法.

3 討論

從本研究結(jié)果可以看到分別用3種不同方法進行黑糯玉米基因組DNA提取時，CTAB法提取的DNA質(zhì)量最好.曾桂萍［13］等對快速提取普通玉米DNA方法的研究中發(fā)現(xiàn)采用普通玉米的盾片提取的DNA的濃度和質(zhì)量明顯高于葉片DNA，本研究分別用黑糯玉米幼苗、種子和盾片3種不同材料提取黑糯玉米基因組DNA時，種子和盾片的提取效果均不如幼苗.推測原因是：與普通玉米相比，黑糯玉米種子（尤其是果種皮）中含有較多的花青素和多酚類物質(zhì)，這些組分可能會影響DNA的提取效果；另外種子和盾片是成熟的組織材料，研磨不夠徹底導(dǎo)致后續(xù)提取過程中提取液較難溶解細胞膜，而健康的幼苗代謝產(chǎn)物少，細胞數(shù)量多，是比較理想的提取基因組DNA的組織材料.

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