王佰雙

摘要：目的 探索細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的染色觀察及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法。 方法 在實(shí)驗(yàn)室條件下，取樣本分別采用涂片、干燥固定、染色和加熱等步驟進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)論 通過(guò)光學(xué)顯微鏡的觀察，了解細(xì)菌芽孢、莢膜和鞭毛染色的原理和意義，學(xué)會(huì)芽孢、莢膜和鞭毛染色的方法。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌；細(xì)菌的染色體；檢驗(yàn)

細(xì)菌（英文：germs；學(xué)名：bacteria），是微生物的主要類(lèi)群之一，屬于細(xì)菌域。廣義的細(xì)菌即為原核生物是指一大類(lèi)細(xì)胞核無(wú)核膜包裹，只存在稱(chēng)作擬核區(qū)（nuclear region）（或擬核）的裸露DNA的原始單細(xì)胞生物，包括真細(xì)菌（eubacteria）和古生菌（archaea）兩大類(lèi)群。人們通常所說(shuō)的即為狹義的細(xì)菌，狹義的細(xì)菌為原核微生物的一類(lèi)，是一類(lèi)形狀細(xì)短，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，多以二分裂方式進(jìn)行繁殖的原核生物，是在自然界分布最廣、個(gè)體數(shù)量最多的有機(jī)體，是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。細(xì)菌的個(gè)體非常小，目前已知最小的細(xì)菌只有0.2微米長(zhǎng)，因此大多只能在顯微鏡下看到它們。細(xì)菌一般是單細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，缺乏細(xì)胞核、細(xì)胞骨架以及膜狀胞器。

1 檢驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 儀器：普通光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌：枯草芽孢桿菌，為24～48h營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物；腸膜狀明串珠菌，為24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)。

1.3 普通變形桿菌：為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂用量0.8%）連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4～5代，每代

培養(yǎng)18～22h。

1.4 染色液：無(wú)菌水（10mL分裝于試管中）、孔雀綠染色液、沙黃染色液、結(jié)晶紫染色液、20%硫。

酸銅溶液、95%乙醇溶液、硝酸銀染色液。

1.5 其他：香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、酒精燈、接種環(huán)、鑷子、燒杯、玻璃棒。

2 細(xì)菌原理：

2.1 芽孢：

芽孢是某些細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段后在菌體內(nèi)形成的休眠體，通常呈圓形或橢圓形。細(xì)

菌能否形成芽孢以及芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊內(nèi)的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒

定細(xì)菌的依據(jù)之一。

芽孢具有厚而致密的壁，通透性低，對(duì)各種不利因素如高溫、冷凍、射線、干燥、化

學(xué)藥品和染料等具有很強(qiáng)的抵抗力。

芽孢染色法是根據(jù)芽孢具有難以染色而一旦染色后又難以脫色的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，所以

芽孢染色法都基于同一原則：選用著色力強(qiáng)的染料進(jìn)行染色。

2.2 芽孢染色法的操作步驟為：

涂片——在潔凈的載玻片中央加一小滴無(wú)菌水，用滅菌的接種環(huán)取少許枯草芽孢桿菌置于水滴中并和水滴充分混勻，并涂成極薄的菌膜。

干燥固定——涂片在空氣中干燥后，手持載玻片一端，有菌膜一面向上，通過(guò)酒精燈的微火三次。注意用手指觸摸載玻片反面，以不燙手為宜。冷卻。

染色和加熱——在涂菌處滴加孔雀綠染色液，并在微火上加熱至染料冒蒸汽開(kāi)始計(jì)時(shí)，加熱染色l0min。注意加熱時(shí)要不斷補(bǔ)充孑L雀綠染色液，以免燒干。

水洗——傾去染色液，冷卻后用水沖洗。

復(fù)染——用沙黃染色液染色1min。

水洗、干燥、鏡檢——結(jié)果：芽孢被染成綠色，營(yíng)養(yǎng)體呈紅色。

2.3 莢膜：

莢膜是包圍在某些細(xì)菌細(xì)胞外的一層黏液狀或膠質(zhì)狀的物質(zhì)，其成分為多糖、糖蛋白或多肽。莢膜與染料的親和力弱，不易著色，再有莢膜物質(zhì)溶于水，用水沖洗時(shí)易被除去。

Anthony染色法是先以結(jié)晶紫作為初染劑，加于未經(jīng)加熱固定的菌膜上，菌體和莢膜均被染成深藍(lán)紫色，然后用20%硫酸銅溶液為脫色劑。

2.4 莢膜Anthony染色法的操作步驟：

涂片——在潔凈的載玻片的一端加2～3滴結(jié)晶紫染色液，用滅菌的接種環(huán)取l環(huán)菌與玻片上的結(jié)晶紫染色液充分混勻。用一塊潔凈的載玻片的窄邊將混勻的菌液刮開(kāi)涂成極薄的菌膜，放置5～7min。

干燥——在空氣中自然干燥。注意切勿用酒精燈加熱。

脫色——用20%硫酸銅溶液沖洗脫色后，在空氣中干燥或用吸水紙吸干。

鏡檢——結(jié)果：莢膜淺藍(lán)色或灰白色，菌體深藍(lán)紫色。

2.5 鞭毛：

細(xì)菌的鞭毛很細(xì)，直徑為10～20nm，用電子顯微鏡可以清楚觀察到。但是若采用特殊染色方法使鞭毛加粗，在普通光學(xué)顯微鏡下也可以看到鞭毛。鞭毛染色方法很多。本實(shí)驗(yàn)采用銀染法進(jìn)行鞭毛染色。

2.6 銀染法進(jìn)行鞭毛染色的操作步驟：

載玻片清洗——選擇新的光滑無(wú)劃痕的載玻片，浸泡于洗潔精充分溶解的水中，煮沸20min，稍冷后取出用自來(lái)水沖洗干凈并瀝干，然后浸泡于95%乙醇溶液中。用時(shí)取出，在酒精燈火焰上燒去酒精后即可使用。

菌液制備——將分裝于試管中的無(wú)菌水緩慢地倒人經(jīng)4～5代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物中，不要搖動(dòng)試管，讓菌體在水中自行擴(kuò)散。注意蒸餾水預(yù)先在恒溫培養(yǎng)箱中保溫，使之于與菌種同溫。置于恒溫培養(yǎng)箱中保溫10min。目的是讓沒(méi)有鞭毛的老菌體下沉，而具有鞭毛的菌體在水中松開(kāi)鞭毛。

涂片——用吸管從菌液上端吸取菌液于潔凈的載玻片一端，稍稍?xún)A斜玻片，使菌液緩慢地流向另一端。

干燥——在空氣中自然干燥。

染色——滴加硝酸銀染色液A液，染色4～6min；用蒸餾水輕輕地充分洗凈A液。用B液沖去殘水，再加硝酸銀染色液8液于玻片上。用酒精燈微火加熱至有蒸汽冒出，維持1mm左右。注意加熱時(shí)應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充B液，不可使玻上B液蒸干。用蒸餾水沖洗，干燥。

鏡檢——結(jié)果：菌體和鞭毛呈深褐色至黑色。

3 檢驗(yàn)步驟：

對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行芽孢染色，鏡檢，并繪圖和描述菌體、芽孢特征。

對(duì)腸膜狀明串珠菌進(jìn)行莢膜染色，鏡檢，并繪圖和描述菌體、莢膜特征。

對(duì)普通變形桿菌進(jìn)行鞭毛染色，鏡檢，并描述鞭毛著生方式。

4 檢驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)光學(xué)顯微鏡的觀察，了解細(xì)菌芽孢、莢膜和鞭毛染色的原理和意義，學(xué)會(huì)芽孢、莢膜和鞭毛染色的方法。

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