徐兵吳林嵐黃素欽楊曉梅吳開木

作者單位：350025福州1福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院肝病研究所；350001福州2福建省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；3福州市菁華崇輝醫(yī)院內(nèi)科

臨床研究

穿刺植入細(xì)管注射阿霉素脂質(zhì)體治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的初步研究

徐兵1吳林嵐2黃素欽1楊曉梅3吳開木2

作者單位：350025福州1福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院肝病研究所；350001福州2福建省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；3福州市菁華崇輝醫(yī)院內(nèi)科

目的建立一種經(jīng)皮向腦間質(zhì)內(nèi)注射藥物以抑制腦膠質(zhì)瘤生長的方法。方法通過埋于皮下的直通接頭和帶有冰套的細(xì)管經(jīng)皮向SD大鼠腦內(nèi)注射生理鹽水（帶管正常對照組）；向腦膠質(zhì)瘤模型大鼠腦內(nèi)分別注射阿霉素（ADR）脂質(zhì)體（ADR脂質(zhì)體組）、ADR水劑（ADR水劑組）、生理鹽水（鹽水對照組）；各組大鼠在注射藥物后5 d、10 d分別以同法再注射一次。在末次注射藥物后4 d，從后3組大鼠中各取8只大鼠測定腦腫瘤體積和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Cr）的水平。其余大鼠常規(guī)繼續(xù)飼養(yǎng)，觀察大鼠生存時(shí)間。結(jié)果治療14 d后，ADR脂質(zhì)體組大鼠腫瘤體積為（27.5±6.4）mm3，明顯低于鹽水對照組的腫瘤體積（57.5±6.3）mm3（P＜0.05）；ADR脂質(zhì)體組大鼠腫瘤抑制率為（52.2±14.6）%，明顯高于ADR水劑組的腫瘤抑制率（27.7±9.5）%（P＜0.05）；ADR脂質(zhì)體組大鼠平均生存期為（42.3±8.2）d，明顯長于ADR水劑組的平均生存期（29.9±4.8）d（P＜0.05）；ADR脂質(zhì)體組和ADR水劑組大鼠的血清ALT、AST、Cr值與鹽水對照組比較差異均不明顯（P均＞0.05）。帶管正常對照組大鼠全部存活50 d以上。結(jié)論帶冰套和金屬芯的細(xì)管易于穿刺植入腦內(nèi)，通過皮下的直通接頭和腦內(nèi)的細(xì)管可經(jīng)皮向腦內(nèi)注入藥物，并明顯抑制腦腫瘤生長，延長荷瘤大鼠存活時(shí)間。

腦腫瘤；阿霉素；脂質(zhì)體；接頭；經(jīng)皮注射；治療

臨床上諸多藥物難以通過血腦屏障，這一直是腦腫瘤化療的難點(diǎn)。腦膠質(zhì)瘤約占腦腫瘤的45%，該腫瘤常常侵入周圍正常腦組織，手術(shù)切除難以切凈，復(fù)發(fā)率較高，但90%的惡性腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)在原病灶周圍2 cm以內(nèi)［1］。通過病灶局部給藥可繞過血腦屏障，殺滅病灶周圍腫瘤細(xì)胞，減少藥物全身毒副反應(yīng)。現(xiàn)有的局部給藥法一般需多次穿刺注射，或術(shù)中一次性給藥，藥物在組織間內(nèi)彌散距離較小［2～7］，故療效不理想，不良反應(yīng)也較多。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一種帶有冰套的細(xì)管直接穿刺植入腦間質(zhì)，可經(jīng)皮穿刺通過埋于皮下的直通接頭和腦內(nèi)的細(xì)管，將藥物注入腦間質(zhì)內(nèi)。我們用該法將阿霉素脂質(zhì)體注入大鼠腦內(nèi)治療腦膠質(zhì)瘤，初步證明了該法的可行性和安全性?，F(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

SD大鼠（雄性，體重280～320 g，SPF級，動(dòng)物合格證號：SCXK滬2007-0005）和C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司）。聚乙烯（PE）細(xì)管外徑為0.5 mm，內(nèi)徑為0.25 mm（上海紅葉塑料制品公司）。金屬管芯長5 cm，外徑為0.1 mm，鈍頭不銹鋼輸注針，注射針頭（PE注射器針頭）。硅膠液及硫化劑（成都中藍(lán)晨光化工研究設(shè)計(jì)院）。阿霉素（ADR）注射液（2mg/ml，浙江海正藥業(yè)）。阿霉素脂質(zhì)體（LI月OD，含ADR 2 mg/ml，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥公司，國藥準(zhǔn)字H20084432）。

1.2 冰套細(xì)管的制備

取一內(nèi)徑為1 mm的玻璃管，管內(nèi)壁涂硅油，200℃烤30 min硅化。20%明膠溶液用微波爐加熱8 s×3次以滅菌。將滅菌明膠溶液加熱溶解后灌入硅化玻管中。將插有管芯的PE細(xì)管插入玻管及明膠溶液中，并置-20℃凍成冰套細(xì)管。將冰套細(xì)管連管芯一并從玻管中拔出，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 直通接頭的制備

將PE注射針頭的大口端和針管截短。以硫化劑加入硅膠液啟動(dòng)固化，取半固化硅膠封蓋于注射接頭的大口，熱壓滅菌并使硅膠完全固化封口，制成直通接頭。

1.4 大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的制備和接頭細(xì)管植入

SD大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，將大鼠頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，手術(shù)暴露顱骨，定位前囟，在前囟后5 mm、矢狀線右旁切開5mm的骨表面，用牙科高速鉆機(jī)在顱骨上鉆開一小孔，暴露硬腦膜并用針刺一小孔，經(jīng)此孔將插有管芯的冰套細(xì)管穿刺入腦內(nèi)8 mm。拔出管芯，保留細(xì)管在腦內(nèi)（細(xì)管外壁冰套將逐漸溶解）。將細(xì)管外口連接于直通接頭的針管。用注射針穿過直通接頭的硅膠封口，順著接頭的三角漏斗狀大口嚴(yán)密地插入接頭內(nèi)的針管口中，通過針管和細(xì)管向大鼠腦內(nèi)注入0.9%NaCl溶液15μl（帶管正常對照）或C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（2×106/L）/15μl制作大鼠腦膠質(zhì)瘤模型。再將直通接頭埋在頭皮下，用骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。術(shù)后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后5 d內(nèi)每天給每只大鼠腹腔注射青霉素10萬U以預(yù)防感染。

1.5 大鼠腦內(nèi)局部抑瘤實(shí)驗(yàn)

大鼠注射接種后6 d，用經(jīng)皮注射法（通過埋于頭皮下的接頭和腦內(nèi)的細(xì)管）向帶管正常對照的大鼠腦內(nèi)注射生理鹽水17μl；向C6腦膠質(zhì)瘤模型大鼠腦內(nèi)注射ADR脂質(zhì)體、ADR水劑（均含ADR 0.1 mg/kg［8］）、生理鹽水各17μl；將大鼠分別作為帶管正常對照組（n=6）、ADR脂質(zhì)體組（n=16）、ADR水劑組（n=16）和鹽水對照組（n=16）處理。在注射鹽水或藥物后5 d、10 d，分別在各組大鼠以同法注射一次。在末次注射治療后4 d，從后3組大鼠中各取出8只大鼠，麻醉后經(jīng)左心室主動(dòng)脈采血樣并快速注入4%多聚甲醛溶液，然后開顱取出大鼠全腦，置10%福爾馬林溶液固定后，沿植入的細(xì)管方向冠狀切開腦瘤并完整取出，按腦瘤垂直和水平方向測量腫瘤直徑，并計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積=a×b2/2（a：腫瘤最大直徑，b：腫瘤最小直徑）［1］。測定大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Cr）的濃度。其余大鼠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)、觀察。

1.6 觀測指標(biāo)

觀察各組大鼠生存期及一般狀況。測算、比較各組荷瘤大鼠的腫瘤體積、腫瘤生長抑制率（對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積）/對照組腫瘤體積×100%［9］、血清ALT、AST、Cr的濃度和平均生存期。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理、分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料中兩組比較用χ2檢驗(yàn)，生存曲線用Kaplan-Meier分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤大鼠生活狀況及存活期

鹽水對照組大鼠接種腫瘤細(xì)胞后活動(dòng)量逐漸減少，飲水、飲食量均減少，皮毛失去光澤，出現(xiàn)腹瀉，對刺激反應(yīng)遲鈍，逐漸消瘦。接種16 d開始發(fā)生死亡，至23 d全部死亡，平均生存期為（20.3±4.6）d。ADR水劑組大鼠生活狀況有所改善，接種后20 d開始發(fā)生死亡，至36 d全部死亡，平均生存期為（29.9±4.8）d。ADR脂質(zhì)體組大鼠生活狀況明顯改善，癥狀出現(xiàn)較晚，接種后28 d開始發(fā)生死亡，至50 d全部死亡，平均生存期為（42.3±8.2）d。3組大鼠的生存曲線見圖1。ADR脂質(zhì)體組大鼠生存期較其他兩組大鼠生存期明顯延長（P＜0.05）。見表1。

2.2 荷瘤大鼠腦腫瘤生長情況

治療后ADR脂質(zhì)體組大鼠的腫瘤體積小于ADR水劑組腫瘤體積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ADR脂質(zhì)體組的腫瘤生長抑制率為（52.2±14.6）%，明顯高于ADR水劑組的相應(yīng)值（27.7±9.5）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。提示阿霉素脂質(zhì)體對腦腫瘤的生長抑制作用更明顯。

2.3 荷瘤大鼠血清肝腎功能指標(biāo)

治療后ADR脂質(zhì)體組和ADR水劑組大鼠血清ALT、AST、Cr值與鹽水對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。提示本法治療對大鼠未見明顯肝腎毒性。

圖1 通過植入的接頭和細(xì)管經(jīng)皮向腦內(nèi)注射不同藥物治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的生存曲線

表1 通過植入的接頭和細(xì)管經(jīng)皮向腦內(nèi)注射不同藥物治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的情況（±s）

表1 通過植入的接頭和細(xì)管經(jīng)皮向腦內(nèi)注射不同藥物治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的情況（±s）

▲分別與鹽水對照組、ADR水劑組比較，P＜0.05；△與ADR水劑組比較，P＜0.05。

組別n腫瘤體積（mm3）鹽水對照組8 57.5±6.3 ADR水劑組8 41.6±5.3 ADR脂質(zhì)體組8 27.5±6.4▲腫瘤生長抑制率（%）平均生存期（d）-20.3±4.6 27.7±9.5 29.9±4.8 52.2±14.6△42.3±8.2▲

表2 通過植入的接頭和細(xì)管經(jīng)皮向腦內(nèi)注射不同藥物治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的血清肝腎功能指標(biāo)

3 討論

臨床上如何更好地對腫瘤局部進(jìn)行化療，一直是腫瘤防治研究的重點(diǎn)之一。有報(bào)道用各種注射器將藥液、凝膠劑［2］、藥粒［3］、脂質(zhì)體［4］等注射到腫瘤病灶，亦有用植入的Ommaya囊［5］向瘤灶注射藥液或直視下將藥物放在瘤灶［6，7］等局部給藥法。但多次注射、局部感染、腫瘤細(xì)胞播散或其他潛在危害常常使治療難以延續(xù)，加之由于局部藥物濃度過高，對正常組織損害較大。有學(xué)者用局部增強(qiáng)對流輸送（convectionenhanced delivery，CED）給藥法治療腦膠質(zhì)瘤，將帶有管芯的聚乙烯（PE）細(xì)管直接插入腦間質(zhì)病灶，細(xì)管外口連接微量注射泵用持續(xù)正壓將藥液注入腦內(nèi)，使藥液在腦間質(zhì)能擴(kuò)散更遠(yuǎn)、更均勻［1，10］。該報(bào)道所用的PE細(xì)管內(nèi)徑僅為50μm至0.76 mm；由于細(xì)管內(nèi)徑小，臨床應(yīng)用時(shí)不易手持定位插入腦內(nèi)病灶，且需將細(xì)管外口引出體外與微量泵對接，插管和長期輸注都不太方便。為此，本研究作了如下改進(jìn)：①先在PE細(xì)管外壁加冰套，冰套含明膠較為堅(jiān)韌，使細(xì)管變粗、變硬，便于手持準(zhǔn)確穿刺植入腦內(nèi)（如細(xì)管較短也可不要冰套，僅需管芯細(xì)管置-20℃凍硬后使用）。⑵植入腦內(nèi)后的冰套在體溫下（＞30℃）會逐漸融化并被機(jī)體吸收，使細(xì)管重新變細(xì)、變軟。⑶注射針可直接嚴(yán)密地插入皮下的直通接頭針管口，將藥液注入與針管相連的細(xì)管，不易漏液。⑷微創(chuàng)穿刺。植入的PE細(xì)管為生物惰性，柔韌光滑，體積小，對組織刺激性小，可植入2根或更多細(xì)管［1，10］。⑸用直通接頭代替可植入泵，可減少污染，適于持續(xù)正壓注射。⑹用脂質(zhì)體劑代替普通注射液（水劑）。脂質(zhì)體主要通過膜融合和內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，可穿過黏膜甚至皮膚［11］，且多位于脂質(zhì)體核心的ADR受到外層膜保護(hù)，可在組織中彌散更遠(yuǎn)、更均勻；并可通過所謂增強(qiáng)滲透和滯留作用，更多地濃集在腫瘤組織釋放藥物，有一定的腫瘤靶向性［12］。本實(shí)驗(yàn)在荷瘤大鼠治療中注入ADR脂質(zhì)體（無須持續(xù)正壓注射）比注入ADR水劑獲得更好的療效。文獻(xiàn)報(bào)道用ADR-聚（二聚酸-SA）共聚酸酐緩釋片（ADR為2.5 mg/kg）瘤旁植入治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的平均生存期為46 d［13］，而本實(shí)驗(yàn)用ADR脂質(zhì)體（ADR為0.1 mg/kg×3）瘤旁注射治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的平均生存期為42.3 d。兩法的大鼠生存期相近，但本法的用藥量僅為前法的1/8，毒副反應(yīng)較低。有報(bào)道用微量泵持續(xù)正壓將卡鉑輸注到腦膠質(zhì)瘤局部，可使荷瘤大鼠生存期≥120 d或出現(xiàn)腫瘤消失［1］。因此如果本法結(jié)合持續(xù)正壓注藥，擴(kuò)大藥物在腦內(nèi)彌散范圍，可能會延長荷瘤大鼠生存期。另外還可在細(xì)管側(cè)壁增加切口或孔，使藥物彌散更快、更廣，用以預(yù)防性給藥。為了防止細(xì)管口堵塞，可定期注入少量惰性氣體（如CO2）沖洗管口的壞死組織。另外還可試用細(xì)管插入蛛網(wǎng)膜下腔，直接將藥物注射到腦表面，使藥物在腦表面濃集（常用的腰椎部行鞘內(nèi)注藥化療，須注入較多藥物才能使藥物擴(kuò)散到腦表面達(dá)到治療濃度，但毒副反應(yīng)較大）。本研究植入的直通接頭和細(xì)管均可長期留在體內(nèi)，因PE材料制造的人工血管、心瓣膜、關(guān)節(jié)等均已廣泛用于臨床，罕有安全性問題的報(bào)道。此外，可用明膠、交聯(lián)明膠或其它可生物降解材料制作細(xì)管或套管。用套管包住不銹鋼注射針管，將針管連同套管刺入體內(nèi)，捅破針管口外套管注藥，將套管留在體內(nèi)，通過套管注藥。細(xì)管和套管可在體內(nèi)降解吸收。

綜上，本研究結(jié)果表明，帶冰套（或凍硬的）PE細(xì)管易于穿刺植入腦間質(zhì)。通過植入的細(xì)管和皮下的直通接頭可經(jīng)皮將ADR脂質(zhì)體注入腦內(nèi)，并明顯抑制腦腫瘤生長。但植入物的長期影響及其遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步研究。

（承蒙我院研究中心陳耕為本文制圖，特致感謝）

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［2015-01-27收稿］［2015-02-25修回］［編輯阮萃才］

Prelim inary study of in jecting adriam ycin liposom es through a thin tube im p lanted in the brain for treating brain glioma in rats

XU月ing1，WU Linlan2，HUANG Suqin1，YANG Xiaomei3，WU Kaimu2（1Institute of Liver Diseases，Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350025，P.R.China；2The Second People′s Hospital of Fujian Province；3Fuzhou Jing-hua Chonghui Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，P.R.China）

XU月ing.E-mail：xubing1228@163.com

ObjectiveTo develop a percutaneousmethod of administering drugs into the brain in order to suppress glioma growth.M ethodSprague-Dawley rats were injected in the brain with 0.9%NaCl solution through a direct adapter implanted under the skin and a thin tube jacketed with an ice sleeve，while rats with brain gliomas

0.9%NaCl solution，aqueous adriamycin or ADR liposomes through a thin tube wrapped in an ice sleeve attached to a device implanted under the skin.The injectionswere repeated 5 and 10 d later.Starting at 4 d after the last injection，tumor volume and serum concen-trations of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），and creatinine（Cr）weremeasured in 8 animals from the saline control group，aqueous ADR group and ADR liposome group.The remaining animals in each group were implanted with tubes but not administered drug or saline in order to assess survival following surgery.Results月y 14 d after the last injection，tumor volumewas significantly smaller in the ADR liposome group（27.5±6.4）mm3than in the saline control group（57.5±6.3）mm3（P＜0.05）.Tumor growth inhibition wassignificantly greater in the ADR liposome group（52.2±14.6）%than in the aqueous ADR group（27.7±9.5）%（P＜0.05），and mean survivalwas significantly longer in the ADR liposome group（42.3±8.2）d vs（29.9±4.8）d（P＜0.05）.Serum concentrations of ALT，AST，Cr were similar between both ADR groups and the saline control group（P＞0.05）.All rats in the control group survived more than 50 d.ConclusionIt is possible to safely and effectively implant a percutaneous drug delivery system through a puncture in the brain.This system，comprising a thin polyester tube with an ice sleeve and metal core，was able to administer ADR to significantly suppress tumor grouth in ratswithout obvious side effects on liver or kidney function.

月rain neoplasm；Adriamycin；Liposome；Adapter；Percutaneous injection；Therapy

R739.41

A

1674-5671（2015）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.05

徐兵。E-mail：xubing1228@163.com