廖治，肖洪濤

(1.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 成都 610072；2.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院 藥學(xué)部，四川 成都 610072)

?

miR-18a和雌激素受體α在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤中的表達

廖治1，肖洪濤2

(1.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 成都 610072；2.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院 藥學(xué)部，四川 成都 610072)

目的 檢測單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤組織中miR-18a及雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERα)的表達，探討miR-18a與ERα的關(guān)系及2者在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤發(fā)生中的作用。方法 采用原位雜交法檢測miR-18a在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤組織石蠟切片中的表達；采用免疫組化法檢測ERα在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤組織石蠟切片的表達。采用相關(guān)分析研究miR-18a和ERα的表達相關(guān)性。結(jié)果 多發(fā)子宮肌瘤組織中的ERα表達水平均明顯高于單發(fā)子宮肌瘤組織(P<0.05)；但miR-18a水平明顯低于單發(fā)子宮肌瘤組織(P<0.05)；相關(guān)分析結(jié)果表明，2者表達呈負相關(guān)(r單發(fā)=-0.4421，r多發(fā)=-0.4181)。結(jié)論 多發(fā)性子宮肌瘤中miR-18a的表達更低，ERα表達更高。miR-18a可作為治療多發(fā)性子宮肌瘤的新靶標。

miR-18a；雌激素受體α；多發(fā)子宮肌瘤；單發(fā)子宮肌瘤

子宮肌瘤是婦科常見良性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但其病因、發(fā)病機制至今尚未完全明了。目前認為子宮肌瘤是一種激素依賴性良性腫瘤，在子宮肌瘤生長過程中，雌激素、孕激素的細胞作用主要為誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、合成調(diào)節(jié)、分化蛋白質(zhì)，而這一作用是雌、孕激素通過作用于靶器官內(nèi)的雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptors，PR)產(chǎn)生的。人的ER有2種亞型即ERα和ERβ，ERα作為雌激素受體之一對子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用。臨床上常見的肌瘤以多發(fā)性子宮肌瘤為主，但也有一部分單發(fā)性子宮肌瘤。以往分子生物學(xué)研究結(jié)果提示[1-3]，單發(fā)性子宮肌瘤是由單克隆平滑肌細胞增殖而成；多發(fā)子宮肌瘤是由不同克隆細胞形成；但是在分子及體液機制下是否有其他的調(diào)控異常，目前尚不明確。

microRNA(miRNA)是一種廣泛存在于真核生物細胞中的非編碼單鏈小分子RNA，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程[4]，并與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤早期診斷及判斷預(yù)后的良好指標[5-6]。miR-18a的表達異常在肝細胞癌、結(jié)腸癌、妊娠期高血壓疾病等多種疾病中得到證實。研究發(fā)現(xiàn)在疾病發(fā)生發(fā)展過程中miR-18a與ERα之間有靶向調(diào)節(jié)關(guān)系[7-9]。

本課題組之前的研究表明[10]，ERα可能是miR-18a的靶基因之一，ERα在子宮肌瘤中的高表達是由于miR-18a的下調(diào)引起的。miR-18a和ERα與子宮肌瘤發(fā)病具有一定的相關(guān)性。為進一步了解miR-18a和ERα在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤中的表達差異，以探索可能的作用機制，本文旨在檢測miR-18a和ERα在單發(fā)及多發(fā)中的表達，探討2者相關(guān)性，為治療子宮肌瘤提供新的依據(jù)和線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選擇四川省人民醫(yī)院2014年1月～2014年7月因子宮肌瘤入院行子宮全切或肌瘤挖除術(shù)的患者60例，其中單發(fā)性子宮肌瘤30例，多發(fā)性子宮肌瘤(≧2個)30例，患者平均年齡(40.2±4.5)歲；取樣的子宮肌瘤直徑均>5 cm，取其切除的肌瘤組織的病理存檔蠟塊。入選患者術(shù)前3個月內(nèi)未服用任何激素類藥物，未合并其他疾病，術(shù)后病理診斷均為子宮平滑肌瘤。

1.2 主要實驗試劑 Has-miR-18a miRCURY LNA Detection probe、地高辛(DIG)標記LNA-miR-18a均購自Exiqon公司；兔抗人ERα(Millipore)、羊抗兔Ⅱ抗(Abcam)購自Abcam公司；SP免疫組化染色試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒、抗原修復(fù)液均購自成都正能生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、多聚甲醛、蘇木素為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法 全部標本均為10%福爾馬林固定、石蠟包埋的子宮肌瘤組織標本，切片厚4 μm。

1.3.1 原位雜交檢測miR-18a的表達：取石蠟包埋組織去石蠟、水化、檸檬酸鹽抗原修復(fù)，49.5 ℃，雜交緩沖液中預(yù)雜交2 h，加入DIG labeled miRCURYTMprobes過夜。加入HRP標記的抗地高辛抗體(1:200)，4 ℃孵育過夜。TBST沖洗，在暗室中加染色溶液，孵育24 h。當達到期望的亮度時，將載玻片移至終止液(1 mM EDTA-PBS溶液)終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測ERα的表達：石蠟組織塊脫蠟、水化后，微波處理使抗原激活。按照抗體說明書要求加入抗體，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。陽性結(jié)果呈棕黃色。

1.4 結(jié)果判定標準 原位雜交及免疫組織化學(xué)結(jié)果應(yīng)用Image-Pro Plus(IPP )軟件進行分析，測量平均光密度(即時IOD/area)；根據(jù)胞漿陽性細胞數(shù)以及染棕黃色及黃色數(shù)的多少來劃分等級，染色分布彌散且陽性細胞>50%為強陽性(+++)，陽性細胞為25%～50%為陽性(++)，陽性細胞10%～25%為弱陽性(+)，陽性細胞<5%或不染色為陰性(-)。

2 結(jié)果

2.1 miR-18a在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤平滑肌細胞中的表達 原位雜交結(jié)果顯示，miR-18a在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤平滑肌細胞中均有表達，miR-18a陽性表達定位于細胞核內(nèi)，為棕黃色染色，見圖1。多發(fā)子宮肌瘤肌細胞中miR-18a平均光密度為82.38±4.26，顯著低于其在單發(fā)子宮肌瘤肌細胞中的表達，為95.11±3.56，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 miR-18a在多發(fā)子宮肌瘤(A)和單發(fā)子宮肌瘤(B)中的表達(×200)Fig.1 Expression of miR-18a in multiple uterine fibroids(A) and single uterine fibroids(B) (×200)

2.2 ERα在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤平滑肌細胞中的表達 ERα在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤平滑肌細胞中均有表達，ERα陽性表達定位于細胞核內(nèi)，為棕黃色染色，見圖2。多發(fā)子宮肌瘤肌細胞中ERα表達水平的平均光密度值為354.47±18.57，顯著高于其在單發(fā)子宮肌瘤肌細胞中的平均光密度值322.15±24.1，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 ERα在多發(fā)子宮肌瘤(A)和單發(fā)子宮肌瘤(B)中的表達(×200)Fig.2 Expression of ERα in multiple uterine fibroids(A) and single uterine fibroids(B) (×200)

2.3 子宮肌瘤中miR-18a表達與ERα表達的相關(guān)性 miR-18a與ERα在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤中的表達均呈負相關(guān)(r=-0.4211，P<0.05；r=-0.4181，P<0.05)。見表1、表2。

表1 miR-18a與ERα在單發(fā)子宮肌瘤中的計數(shù)表達(n=30)Tab.1 miR-18a and ER alpha count in single uterine fibroids(n=30)

*P<0.05

表2 miR-18a與 ERα在多發(fā)子宮肌瘤中的計數(shù)表達(n=30)Tab.2 miR-18a and ER alpha count in multiple uterine fibroids(n=30)

*P<0.05

3 討論

子宮平滑肌瘤是雌激素依賴性疾病，已有研究證實肌瘤組織中ER、mRNA表達成倍增加，雌激素通過其受體ERα和ERβ發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，子宮肌瘤的發(fā)生與患者局部內(nèi)分泌環(huán)境異常有關(guān)，在女性子宮中以ERα為主[11]，盡管外周血中雌激素水平相似，但是局部組織受體密度可能決定其最終效應(yīng)。ERα作為雌激素受體之一對子宮平滑肌瘤的發(fā)生、發(fā)展起到關(guān)鍵作用。

miRNA廣泛參與了人類及各種生物的生理病理過程，腫瘤的發(fā)生中miRNA也起著重要的作用。有關(guān)子宮肌瘤發(fā)生中miRNA的報道最早見于2007年，一個miRNA可以調(diào)節(jié)多個靶基因的表達，幾種miRNA也可以共同調(diào)控一個靶基因的表達。miRNA主要通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補配對而負調(diào)控基因表達，當miRNA和目的mRNA完全互補時，降解目的mRNA；當不完全互補時，則負向調(diào)控翻譯過程，阻礙蛋白質(zhì)翻譯[12-13]。在子癇前期孕婦胎盤組織中發(fā)現(xiàn)miR-18a的病理性低表達[14-16]，并且初步預(yù)測出其靶基因是ERα。但在子宮肌瘤中這2者的相關(guān)性研究仍然較少。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a在子宮肌瘤中表達下降，ERα則在肌瘤組織中高表達。且在同一位患者樣本中，miR-18a在子宮肌瘤組織中低表達，而ERα在肌瘤組織中高表達，表明2者之間存在負向調(diào)節(jié)。這種負向調(diào)節(jié)暗示ERα可能是miR-18a的靶基因之一，即ERα在子宮肌瘤中的高表達是由于miR-18a表達下調(diào)引起的。因此miR-18a和ERα與子宮肌瘤發(fā)病存在一定的聯(lián)系。

本研究分單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤2組，且肌瘤直徑均在5 cm以上，結(jié)論提示多發(fā)子宮肌瘤的ERα表達水平均明顯高于單發(fā)子宮肌瘤，但miR-18a水平則比單發(fā)子宮肌瘤組織中的表達弱；同一肌瘤組織中這2者表達呈負相關(guān)。說明多發(fā)性子宮肌瘤中miR-18a的缺失更明顯，可能導(dǎo)致多發(fā)肌瘤中ERα表達水平進一步增加。ERα的增多放大了雌激素的作用，肌瘤局部的“高雌激素受體環(huán)境”加速了靶細胞分裂、增殖，可能啟動了子宮肌瘤的發(fā)生且同時導(dǎo)致肌瘤多發(fā)；而其上游調(diào)控基因miR-18a通過影響ERα表達參與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究結(jié)果表明miR-18a可能成為治療子宮肌瘤的新靶標，為揭示其發(fā)病分子機制和治療子宮肌瘤提供了新線索。但miRNAs作為基因調(diào)控機制中一個新成員，其具體調(diào)控機制還有待進一步研究，這將是下一步研究的方向。

[1] Lin SL,Chang D,Ying SY.Asymmetry of intronic pre-miRNA structures in functional RISC assembly[J].Gene,2005,356(15):32-38.

[2] Maniataki E,Mourelatos Z.A human,ATP-independent,RISC assembly machine fueled by pre-miRNA[J].Genes Dev,2005,19(24):2979-2990.

[3] Miyoshi K,Okada TN,Siomi H,et al.Characterization of the miRNA-RISC loading complex and miRNA-RISC formed in the Drosophila miRNA pathway[J].RNA,2009,15(7):1282-1291.

[4] Bartel DP.MicroRNAs: genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell,2004，116(2):281-297。

[5] Podshivalova K,Salomon DR.MicroRNA regulation of T-lymphocyte immunity: modulation of molecular networks responsible for T-cell activation, differentiation，and development[J].Crit Rev Immunol,2013,33(5):435-476.

[6] Murakami Y,Toyoda H,Tanaka M,et al.The progression of liver fibrosis is related with overexpression of the miR-199 and 200 families[J].PLoS One,2011,6(1):e16081.

[7] Liu WX,Yeh SH,Lu CC,et al.MicroRNA-18a prevents estrogen receptor-α expression, promoting proliferation of hepatocellular carcinoma cells[J].Gastroenterology,2009,136:683-693.

[8] Kumar MS, Lu J, Mercer KL,et al.Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis[J].Nat Genet,2007,39(5):673-677.

[9] Martello G,Rosato A,Ferrari F,et al.A MicroRNA targeting dicer for metastasis control[J].Cell,2010,141(7):1195-1207.

[10] Liao Z,Xiao HT,Zhang Y,et al.IL-1β:a key modulator in asthmatic airway smooth muscle hyper-reactivity[J].Expert Rev Respir Med,2015,9(4):429-436.

[11] Sakaguchi H,Fujimoto J,Hong BL,et al,Quantitative analysis of estrogen receptor proteins in rat ovary[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2005,94(1-3):83-91.

[12] Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed often flanked adenosines,indicates that thousands of genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[13] Krek A,Grun D,Poy MN,et al.Combinatorial microRNA target predictions[J].Nat Genet,2005,37(5):495-500.

[14] Schiessl B,Mylonas I,Hantschmann P,et al.Expression of endothelial NO synthase, inducible NO synthase, and estrogen receptors alpha and beta in placental tissue of normal, preeclamptic, and intrauterine growth-restricted pregnancies[J].Histochem Cytochem,2005,53:1441-1449.

[15] 湯雅玲，冉靜，趙巖.宮頸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子ZEB1與microRNA-200c的關(guān)系[J].中國生化藥物雜志，2015，35(6)：95-97.

[16] Huang G,Nishimoto K,Zhou Z,et al.miR-20a encoded by the miR-17-92 cluster increases the metastatic potential of osteosarcoma cells by regulating Fasexpression[J].Cancer Res,2012,72(4):908-916.

(編校：吳茜)

MiR-18a and estrogen receptor alpha expression in single and multiple uterine fibroids

LIAO Zhi1, XIAO Hong-tao2

(1 Department of Gynecology and Obstetrics, Hospital of the University of Electronic Science and Technology of China, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China;2.Department of Pharmacy, Hospital of the University of Electronic Science and Technology of China, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China)

ObjectiveTo detect the expression of miR-18a and estrogen receptor alpha (ER alpha) in single and multiple uterine flesh tumor tissues, discuss the relationship between miR-18a and ER alpha, and their effect in single and multiple uterine fibroids.MethodsThe expression of miR-18a and ER alpha in single and multiple uterine fibroids tissue paraffin section were detected by in situ hybridization method and immunohistochemical method, respectively.And the correlation between the miR-18a and ER alpha were evaluated.ResultsThe expression of ER alpha in multiple uterine fibroids group was significantly higher than that of single uterine fibroids tissues (P<0.05); while miR-18a was weaker than that of single uterine fibroids tissues(P<0.05).The correlation results showed that miR-18a expression was correlated negatively with ER alpha expression either in single(r=-0.4421) and multiple uterine fibroids(r=-0.4181).ConclusionThe expression of miR-18a is low in multiple uterine fibroids, while ER alpha had high expression.miR-18a could bea new target for the treatment of multiple uterine fibroids.

miR-18a; estrogen receptor alpha.multiple uterine fibroids; single uterine fibroids

四川省衛(wèi)生廳項目(100491，120111)，四川省人民醫(yī)院青年基金(30305030606，30305030859)；四川省科技廳項目(2014FZ0103，2015JQO027，2015ZR0160)

廖治，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科，E-mail：liaozhi130@163.com；肖洪濤，通訊作者，男，博士，副主任藥師、副研究員，研究方向：臨床藥理學(xué)，E-mail：xht927@163.com。

R737

A

1005-1678(2015)09-0054-03