霍婷,孫凱,汪磊,李子健,郭盛強(qiáng)

(西安力邦醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，陜西 西安 710075)

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二丁酰環(huán)磷腺苷鈉的制備及其含量和相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

霍婷,孫凱,汪磊,李子健,郭盛強(qiáng)

(西安力邦醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，陜西 西安 710075)

目的 制備二丁酰環(huán)磷腺苷鈉并測(cè)定其含量及有關(guān)物質(zhì)。方法 自制二丁酰環(huán)磷腺苷鈉后，采用高效液相色譜法測(cè)定其含量和有關(guān)物質(zhì)，色譜條件為：ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.05 mol/mL磷酸二氫鉀溶液(25:75)為流動(dòng)相，流速1 mL/min，273 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果 二丁酰環(huán)磷腺苷鈉為白色粉末狀固體(收率>70%，HPLC>99%)；含量測(cè)定線性范圍為20～30 μg/mL，r=0.9997；重復(fù)性良好(RSD=0.4%，n=6)；回收率為101.2%(RSD=0.3%)；有關(guān)物質(zhì)定量限為50.08 ng/mL，該濃度下檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定；線性范圍為0.05～3.75 μg/mL，r=0.9999；重復(fù)性良好(RSD=4.53%，n=6)；回收率為93.5%(RSD=1.8%)。 結(jié)論 該合成路線簡(jiǎn)單，制備得到二丁酰環(huán)磷腺苷鈉純度高，建立的HPLC法測(cè)定其含量及有關(guān)物質(zhì)簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠。

二丁酰環(huán)磷腺苷鈉；制備；含量；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)

環(huán)腺苷酸(adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate，cAMP)是生長(zhǎng)激素、腎上腺素等多種激素作用的第二信使，是動(dòng)物機(jī)體代謝的重要調(diào)節(jié)因子。有資料顯示它對(duì)心絞痛、急性心肌梗塞、牛皮癬有特效[1]。通過(guò)化學(xué)方法對(duì)cAMP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，在分子中加入兩個(gè)丁?；?，使其具有較好的脂溶性，克服了cAMP使用上的局限性，可通過(guò)細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[2]，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成cAMP，激活蛋白磷酸化酶，增強(qiáng)心肌功能，改善外周血管循環(huán)，解除休克時(shí)胰島素分泌的抑制，促進(jìn)組織對(duì)糖的攝取，改善能量代謝；還能對(duì)抗機(jī)體內(nèi)磷酸二酯酶的降解作用，作用時(shí)間較為持久和迅速，因此具有更廣闊的應(yīng)用前景。為此，本文研究合成了一種新型cAMP的衍生物—二丁酰環(huán)磷腺苷鈉(dbcAMP-Na)，該物質(zhì)合成方法文獻(xiàn)報(bào)道較多的是由cAMP經(jīng)三乙胺鹽保護(hù)、吡啶作溶劑?；蟪甥}而成[3-5],本文采用方法將cAMP先制備成鈉鹽，然后以正丁酐既做反應(yīng)物又做溶劑酰化得到目標(biāo)產(chǎn)物，該法具有合成步驟少，產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，參考已有報(bào)道的鈣鹽有關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，采用高效液相色譜法對(duì)自制dbcAMP-Na的含量及有關(guān)物質(zhì)分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 二丁酰環(huán)磷腺苷鈉供試品(力邦醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司自制，5批：140707、140729、140814、140909、140915，制備方法見(jiàn)1.3)，二丁酰環(huán)磷腺苷鈉(N6-2′-O-Dibutyryladenosine 3′，5′-cyclic monophosphate sodium salt)對(duì)照品(Sigma標(biāo)準(zhǔn)品，Lot#SLBG4203V)，雜質(zhì)(N6-monobutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt)對(duì)照品(Sigma標(biāo)準(zhǔn)品，Lot#129K2101)，環(huán)磷腺苷(杭州美亞藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20083070)。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 LumTech高效液相色譜儀(配有Autosampler 5500進(jìn)樣器，K-2501UV Detecter，WATERS 2998 PDA，Clarity工作站)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌；DZF-6050真空干燥箱。

1.3 二丁酰環(huán)磷腺苷鈉的制備 在裝有環(huán)磷腺苷的燒瓶里緩慢滴加氫氧化鈉水溶液(3 mol/L)，過(guò)程控溫，滴加完畢升溫至室溫，用HCl溶液(20%)調(diào)節(jié)pH至7～8，加入無(wú)水乙醇析出白色固體，過(guò)濾、干燥得白色固體鈉鹽；將鈉鹽與正丁酐在N2保護(hù)下升溫至140 ℃反應(yīng)，TLC監(jiān)控，反應(yīng)完全后降至室溫，緩慢加入甲基叔丁基醚，過(guò)程劇烈攪拌，得近白色固體粗品。甲基叔丁基醚與丙酮的混合溶液重懸得到白色粉末狀目標(biāo)產(chǎn)物。

1.4 二丁酰環(huán)磷腺苷鈉的測(cè)定

1.4.1 對(duì)照品及供試品溶液：取dbcAMP-Na對(duì)照品及自制樣品(批號(hào)：140915)各約25 mg，精密稱定，分別置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻作為儲(chǔ)備液。精密量取各儲(chǔ)備液5 mL置于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，即配制成25 μg/mL的對(duì)照品及供試品溶液。

1.4.2 高濃度供試品溶液：用十萬(wàn)分之一的天平取自制dbcAMP-Na樣品約25 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，作為供試品儲(chǔ)備液。再精密量取高濃度儲(chǔ)備液2 mL置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻即為濃度0.5 mg/mL的高濃度供試品溶液。

1.4.3 雜質(zhì)對(duì)照品溶液：精密稱定雜質(zhì)對(duì)照品約25 mg，置于100 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，搖勻做為雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL至100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，即配制成2.5 μg/mL的雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

1.4.4 色譜條件：色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀與0.01 mol/L TBAB混合溶液(25:75)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

① 線性關(guān)系：精密稱取dbcAMP-Na對(duì)照品25.65 mg置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取8、8.8、9.6、10.0、10.4、11.2和12.0 mL分別置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋定容。分別取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積(n=3)。

② 儀器精密度：按照1.4.1項(xiàng)下方法配制得24.93 μg/mL的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別以峰面積和保留時(shí)間考察儀器的進(jìn)樣精密度。

③ 溶液穩(wěn)定性：按照1.4.1項(xiàng)下配制得24.47 μg/mL的對(duì)照品溶液和25.01 μg/mL的樣品溶液，各取20 μL，分別于0、1、2、4、6、8、12和24 h時(shí)注入液相色譜儀，考察2者的溶液穩(wěn)定性。

④ 重復(fù)性：精密稱取dbcAMP-Na同一批次樣品6份，每份約25 mg，按1.4.1項(xiàng)下方法配制成溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)峰面積(n=3)。

⑤ 回收率試驗(yàn)：配制濃度為0.983 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液待用，精密量取約15 mg的dbcAMP-Na樣品9份，添加不同量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配制成濃度為20，25，30 μg/mL的溶液各3份，進(jìn)行加樣回收率測(cè)定。

⑥ 含量測(cè)定：取一定量對(duì)照品及不同批次自制dbcAMP-Na樣品，按本試驗(yàn)方法配制溶液，進(jìn)樣液相色譜分析，外標(biāo)法計(jì)算出各批樣品含量(n=3)。

1.5 相關(guān)物質(zhì)測(cè)定

1.5.1 色譜條件同1.4.4項(xiàng)下。

1.5.2 線性關(guān)系：精密稱取雜質(zhì)對(duì)照品25.04 mg置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別量取不同量的7份溶液置入容量瓶中，流動(dòng)相稀釋成濃度依次為0.050、0.100、1.00、2.00、2.50、3.00、3.75 μg/mL的雜質(zhì)對(duì)照品溶液，取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積(n=3)。

1.5.2 重復(fù)性：精密稱取dbcAMP-Na同一批次樣品6份，每份約25 mg，按照1.4.3的方法配制成濃度為50 mg/mL的樣品溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)峰面積(n=3)。

1.5.3 回收率試驗(yàn)：配制濃度為25 μg/mL的雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液待用，精密量取約25 mg的dbcAMP-Na樣品(雜質(zhì)含量按0.0211%計(jì))9份，添加不同量的雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配制成雜質(zhì)濃度為1.23，2.48，3.73 μg/mL的溶液各3份，進(jìn)行加樣回收率測(cè)定。

1.5.4 未知雜質(zhì)測(cè)定：按照1.4.2項(xiàng)下的方法配制濃度為0.5 mg/mL的樣品供試溶液，稀釋200倍得濃度為2.5 μg/mL的自身對(duì)照溶液。取上述兩種溶液各20 μL分別進(jìn)樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍，各未知雜質(zhì)峰面積總和小于對(duì)照溶液主成分峰的峰面積(0.5%)。采用自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量。

2 結(jié)果

2.1 制備的二丁酰環(huán)磷腺苷鈉 制備的二丁酰環(huán)磷腺苷鈉為白色粉末狀固體(收率>70%，HPLC>99%)已知降解雜質(zhì)為酯水解產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)及HPLC圖譜見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 二丁酰環(huán)磷腺苷鈉及有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of dbcAMP-Na and its related substances

圖2 二丁酰環(huán)磷腺苷鈉HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of dbcAMP-Na

2.2 二丁酰環(huán)磷腺苷鈉的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系：3次測(cè)定的峰面積平均值對(duì)對(duì)照品溶液濃度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=38.91C+2.840 r=0.9997，表明在20～30 μg/mL的范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 儀器精密度：精密度RSD峰面積為1.1%，RSD保留時(shí)間為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 溶液穩(wěn)定性：對(duì)照品溶液的平均峰面積為955.121，RSD為1.5%；樣品溶液的平均峰面積為961.630，RSD為1.7%。雜質(zhì)含量與初始溶液濃度相比無(wú)明顯變化，即對(duì)照品溶液和樣品溶液至少在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性：樣品平均含量為101.08%，RSD為0.4%(n=6)，表明該法重復(fù)性良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn)：加樣回收率高、中、低3個(gè)濃度加樣回收率(n=3)依次為101.3%、101.1%、101.3%；總平均回收率為：101.2%，RSD為0.3%，表明dbcAMP-Na在以上3個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)回收率良好。

2.2.6 含量測(cè)定：各批樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同批次樣品的含量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination result of different batches sample

2.3 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.3.1 最低檢測(cè)線和定量限：當(dāng)信噪比為3時(shí)，降解雜質(zhì)的最低檢測(cè)限為12.52 ng；當(dāng)信噪比為10時(shí)，定量限為50.08 ng，該樣品連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算平均保留時(shí)間為6.153 min，RSD值為0.11%，平均峰面積為2.364，RSD值為2.26%，說(shuō)明在該定量限下，檢測(cè)值穩(wěn)定。

2.3.2 重復(fù)性：dbcAMP-Na同一批次樣品的平均含量為0.0211%，RSD為4.53%(n=6)，表明該法重復(fù)性良好。

2.3.3 線性關(guān)系：3次測(cè)定的峰面積平均值對(duì)雜質(zhì)對(duì)照品溶液濃度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=43.53C+0.343，r=0.9999，表明在0.05～3.75 μg/mL的范圍內(nèi)雜質(zhì)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 回收率試驗(yàn)：高、中、低3個(gè)濃度雜質(zhì)加樣回收率(n=3)依次為95.4%，92.2%，93.0%；總平均回收率為：93.5%， RSD為1.8%，表明該降解雜質(zhì)在以上3個(gè)濃度梯度上回收率良好。

2.3.5 未知雜質(zhì)測(cè)定：6份樣品中各未知雜質(zhì)平均含量均小于0.5%，雜質(zhì)峰面積RSD均小于10%。

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取一定量的二丁酰環(huán)磷腺苷鈉對(duì)照樣品，配制成約50 μg/mL的溶液，用分光光度法在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果本品在272.3 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，將檢測(cè)波長(zhǎng)定為273 nm；流動(dòng)相的選擇 采用乙腈-水(25:75)為流動(dòng)相，考慮到樣品鈉鹽易電離，極性大，在流動(dòng)相中加入磷酸二氫鉀緩沖鹽，并加入少量表面活性劑增加其溶解性，能顯著改善拖尾，得到較好的色譜圖形。改變流動(dòng)相流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min，柱溫分別為30、35、40 ℃條件下以及采用2種不同的色譜柱(Agilent 5 TC-C18(2)；Ultimate XB-C18)進(jìn)行檢測(cè)，平均含量為99.16%，RSD為0.6%(n=3)。經(jīng)驗(yàn)證，該檢測(cè)方法重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于該藥的質(zhì)量控制。

本法專一性強(qiáng)，含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度均好，完全能夠滿足二丁酰環(huán)磷腺苷鈉質(zhì)量分析的要求，為控制二丁酰環(huán)磷腺苷鈉的質(zhì)量提供了可靠的定量方法依據(jù)。

[1] 馬世昌.化學(xué)物質(zhì)辭典[M].西安：陜西科技技術(shù)出版社，1999：428.

[2] 高市爭(zhēng)，張曦，劉勇，等.二丁酰環(huán)腺苷酸的合成與性質(zhì)研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2004，40(2)：16-18.

[3] Newton RP, Walton TJ. Evans AM,et al. Identification of cyclic nucleotide derivatives synthesized for radioimmunoassay development by fast atom bombardment with collision-induced dissociation and mass-analysed ion kinetic energy spectroscopy[J].Organic Mass Spectrometry, 28(8):679-688.

[4] Yamasa Shoya KK,JGC Corp,Kansai Paint Co.LTD.Process for producing ribonucleosides[P].DE 2416709,1974.

[5] Chait EM,Choi SY,Greensboro,et al.Synthesis and method of purification of cycfic nucfeo tide derivatives.[P].US186282 A1,2004.

[6] 饒印保，鄭金芳.注射用二丁酰環(huán)磷腺苷鈣含量高效液相測(cè)定法[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18(6)：36.

[7] 馮新俠，閆平川.高效液相色譜法測(cè)定二丁酰環(huán)磷腺苷鈣及其凍干粉針的含量[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，14(1)：19-21.

(編校：王冬梅)

Preparation of sodium dibutyryladenosine cyclophosphate and the determination of the content and related substances

HUO Ting,SUN Kai,WANG Lei,LI Zi-jian,GUO Sheng-qiang

(Xi’an Libang Pharmaceutical Co.LTD, Xi’an 710075, China)

ObjectiveTo prepare sodium dibutyryladenosine cyclophosphate(dbc AMP-Na)，and determine the content and related substances. MethodsDetermine the content and related substances of dbcAMP-Na by high performance liquid chromatography after prepared,The column：ODS C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm)；the mobile phase：acetonitrile-0.05mol/mL KaH2PO4solution(25:75)；the flow rate：1 mL/min；the content of dbcAMP-Na was detected at 273 nm. ResultsThe linear range of the determination of the content was 20～30 μg/mL，and the correlation coefficient was 0.9997；The precision was good(RSD=0.4%，n=6)；The recovery result was 101.2%(RSD=0.3%). The quantitative limit of relevant material is 50.08 ng/mL，which is stable under this concentration；The linear range of the determination was 0.05～3.75 μg/mL，r=0.9999；The precision was good(RSD=4.53%，n=6)；The recovery result was 93.5%(RSD=1.8%). ConclusionThe synthetic route of dbcAMP-Na is simple and with high product purity. The method to determine the content and related substances of dbcAMP-Na is easy to operate and the results of the determination are accurate。

sodium dibutyryladenosine cyclophosphate;prepare;content; HPLC;related substances

霍婷，女，碩士，工程師，研究方向：原料藥及藥物的合成制備與分析，E-mail：huoting-714@163.com。

R927

A

1005-1678(2015)02-0171-03